UE5 Acides aminés et peptides : structure, propriétés et méthodes d'analyse

I. Acides Aminés

Les acides aminés (aa) sont les unités monomériques des protéines. Leur classification est essentielle pour comprendre les interactions au sein des peptides et des protéines.

1. Les Acides Aminés Essentiels chez l'Homme

Il existe 9 acides aminés essentiels que le corps humain ne peut pas synthétiser et qui doivent être apportés par l'alimentation. Les autres sont produits in vivo.

• Histidine

• Leucine

• Thréonine

• Lysine

• Tryptophane

• Phénylalanine

• Valine

• Méthionine

• Isoleucine

Moyen mnémotechnique : Historiquement Le Très Lyrique Tristan Fait Vachement Méditer Iseult.

2. Les Propriétés Physico-Chimiques des Acides Aminés

Solubilité

• Les acides aminés sont solubles dans l'eau, mais faiblement autour de leur pHi (pH isoélectrique, où la charge nette est neutre).

• La solubilité augmente en milieu alcalin (formation de sels).

• Les petits acides aminés (ex: Glycine) ou ceux avec des chaînes latérales polaires sont plus solubles.

• Exemples :

  • Tyrosine (Tyr ; Y) : peu soluble (noyau aromatique).

  • Valine (Val ; V) : plus soluble (aliphatique).

  • Arginine (Arg ; R) : très basique, polaire, soluble.

  • Cystéine (Cys ; C) : très soluble (chaîne latérale courte -SH).

  • Sérine (Ser ; S) : particulièrement soluble (-OH).

• Solubles dans d'autres solvants polaires (ex: alcool éthylique, notamment la Proline).

• Moins solubles dans les solvants apolaires ; la solubilité dépend de la chaîne latérale :

  • Plus la chaîne latérale a d'atomes de carbone, moins l'aa est soluble.

  • La présence de fonctions polaires (-NH₂, -COOH) ou hydrophiles (-OH) augmente la solubilité.

Stéréochimie des Acides α-Aminés

• Un acide aminé contient un groupement amine (NH₂) et un groupement carboxylique (COOH).

• Les acides aminés des protéines sont des acides α-aminés : la fonction amine est en position α de la fonction acide.

• Le Carbone α (Cα) est lié à 4 groupes différents (COOH, NH₂, H, R) et est donc chiral, sauf pour la Glycine (R=H).

• Projection de Fischer :

  • Représentation linéaire où la chaîne carbonée principale est verticale, le carbone le plus oxydé en haut.

  • Les liaisons horizontales sont situées au-dessus du plan de projection.

  • La configuration (D) ou (L) est donnée par le premier carbone asymétrique (le plus bas numériquement).

  • Si NH₂ est à gauche → L (Left), si à droite → D (Droite).

  • Tous les acides aminés optiquement actifs du règne animal sont de la série L (sauf quelques D chez les micro-organismes).

  • L'appartenance à la série L ou D n'indique pas le caractère lévogyre/dextrogyre ni la configuration R/S.

• La Thréonine et l'Isoleucine possèdent un deuxième centre chiral (carbone β ou carbone 3). Leurs énantiomères (L) existent sous deux formes épimériques (différant par la configuration d'un seul centre asymétrique), l'épimère non retrouvé dans les protéines étant préfixé par "allo".

Couleur et Absorption de la Lumière Visible et Ultraviolets

• Les solutions d'acides aminés sont incolores.

• La plupart absorbent à λ < 230 nm.

• Certains acides aminés absorbent entre 260 nm et 290 nm (ultraviolet), ce qui est utile pour détecter les protéines :

  • Tyrosine et Tryptophane absorbent fortement vers 280 nm.

  • Phénylalanine absorbe à des longueurs d'ondes plus courtes (260-270 nm), moins utile pour le dosage des protéines.

• Utilisation : Détection de contamination d'acides nucléiques par des protéines. Un taux d'absorption élevé à 280 nm indique une contamination protéique.

3. Méthodes d'Études des Acides Aminés

Ces méthodes sont basées sur la solubilité ou la charge des acides aminés.

Méthodes basées sur la solubilité des acides aminés

La chromatographie est une méthode physico-chimique de séparation des substances d'un mélange, basée sur des différences de comportement entre une phase mobile (liquide ou gazeuse) et une phase stationnaire (solide ou liquide).

• Phase mobile : Gaz (chromatographie en phase gazeuse) ou liquide (chromatographie sur papier, couche mince, colonne), appelée éluant.

• Phase stationnaire :

  • Solide : silice ou alumine traitée (propriétés adsorbantes), utilisée en colonne (gravité, HPLC) ou en couche mince (CCM).

  • Liquide : imprègne un support solide ou est fixée sur un support (phase greffée).

La Chromatographie sur Couche Mince (CCM)

C'est une chromatographie planaire avec une phase mobile liquide.

• Phase stationnaire : Couche mince de matériel adsorbant (gel de silice, oxyde d'aluminium) sur une plaque (CCM ou TLC).

• Phase mobile : Solvant ou mélange de solvants (éluant).

• Procédé :

  1. Dépôt de l'échantillon d'acides aminés à une extrémité de la plaque (ligne de dépôt), puis séchage.

  2. La plaque est plongée dans l'éluant (la ligne de dépôt ne doit pas être immergée).

  3. L'éluant migre par capillarité, entraînant les composés du mélange qui se séparent.

• Facteurs de séparation :

  • Solubilité : Plus un aa est soluble, plus il remonte la plaque.

  • Interactions avec la silice : Plus les interactions sont fortes, moins l'aa se déplace.

  • Taille : Plus le composé est grand, plus il remonte la plaque.

• Détection : Après séchage, les acides aminés sont révélés par un réactif (ex: ninhydrine).

• Référence : Le R_F (rapport de front) est le rapport entre la distance parcourue par l'aa (x) et la distance parcourue par l'éluant (y). R_F < 1.

  • Un soluté très soluble dans la phase fixe (forte interaction) a un R_F faible.

  • Un soluté très soluble dans la phase mobile (faible interaction avec la phase fixe) a un R_F élevé (proche de 1).

• Le R_F est difficilement reproductible. On préfère le R_X (distance aa / distance corps de référence X).

La Chromatographie sur Papier

• Similaire à la CCM, mais le support (phase stationnaire) est du papier (cellulose).

• Phase mobile : Mélange d'alcool (n-butanol), acide acétique et eau (3:3:1).

• Les acides aminés polaires sont plus retenus par la cellulose (ponts H) et migrent moins.

• Révélation avec la ninhydrine.

La Chromatographie en Phase Gazeuse

• S'applique aux composés gazeux ou vaporisables (dont les acides aminés).

• L'échantillon est vaporisé à l'entrée d'une colonne (phase stationnaire solide ou liquide).

• Un gaz porteur/vecteur (phase mobile) transporte le mélange.

• Les molécules se séparent et sortent de la colonne avec un temps propre à chacune, permettant d'étudier leur affinité avec la phase stationnaire.

• Appareils (chromatographes) :

  • Four : Chauffe pour augmenter l'agitation moléculaire et libérer les composés.

  • Système d'injection : Introduit et volatilise l'échantillon.

  • Colonne (capillaire ou remplie) : Sépare les molécules.

  • Système de détection : Mesure le signal (colorimétrie, UV) pour identifier les molécules.

  • Système de détendeur-régulateur : Pour les gaz utilisés (hélium, dihydrogène, diazote, air comprimé).

Méthodes basées sur la charge des acides aminés

L'Électrophorèse

Les acides aminés sont amphotères (se combinent aux acides et aux bases). Ils peuvent être séparés selon leur pHi (point isoélectrique).

• Principe : Application d'un champ électrique à un mélange d'acides aminés dans un tampon à un pH donné.

• Migration :

  • Si pHi > pH du tampon : l'aa est globalement chargé positivement et migre vers la cathode (électrode négative).

  • Si pHi < pH du tampon : l'aa est globalement chargé négativement et migre vers l'anode (électrode positive).

  • Si pHi ≈ pH du tampon : l'aa est globalement neutre et ne migre pas.

• Exemple : Tampon à pH=6.

  • Alanine (pHi=6.0) : ne migre pas.

  • Arginine (pHi=10.7) : chargée positivement, migre vers l'électrode négative.

  • Acide aspartique (pHi=3.0) : chargé négativement, migre vers l'électrode positive.

La Chromatographie Échangeuse d'Ions

Méthode importante pour séparer les acides aminés, peptides ou protéines en fonction de leur charge globale.

• Principe : Utilise une phase stationnaire (matrice) chargée qui échange des ions avec la phase mobile.

• Étapes :

  1. Adsorption (A) : Les ions du mélange se lient à la matrice chargée. Ex: si matrice positive, elle retient les éléments chargés négativement.

  2. Lavage (B) : Élimination des ions non liés.

  3. Élution/Désorption sélective (C) : Les éléments retenus sont décrochés en variant la force ionique ou le pH du tampon d'élution, ce qui modifie la charge de la molécule et ses interactions avec la matrice.

• Rappels sur la charge nette :

  • pHi : pH où la charge nette est zéro.

  • Si pH > pHi : charge nette négative (liaison échange de type anionique).

  • Si pH < pHi : charge nette positive (liaison échange de type cationique).

• Précautions :

  • Éviter les pH extrêmes qui dénaturent les acides aminés/protéines.

  • Tenir compte de la distribution et du nombre de charges sur la molécule :

    • Molécules peu chargées : faiblement retenues, élution à faible force ionique.

    • Molécules fortement chargées : fortement retenues, élution à forte force ionique.

• Séparation : Réalisée avec un gradient de sels, un gradient de pH, ou une combinaison des deux.

• Types de supports (échangeurs d'ions) :

  • Résine cationique : Chargée négativement, échange des cations (retient les cations). Ex: CM-polyoside (échangeur cationique faible).

  • Résine anionique : Chargée positivement, échange des anions (retient les anions). Ex: DEAE-polyoside (échangeur d'anion faible).

II. Peptides

1. Définitions

• Une protéine est un polymère d'acides aminés (appelés résidus) unis par des liaisons peptidiques.

• La conformation native est le repliement unique d'une protéine, lui conférant ses propriétés spécifiques (enzymatiques, mécaniques, stabilité).

• Les peptides sont des polymères d'acides aminés, mais plus petits que les protéines.

  • Peptides : < 50 acides aminés.

  • Protéines : > 50 acides aminés.

  • L'insuline (51 aa) est considérée comme la plus petite des protéines.

• Dans un peptide :

  • Le résidu le plus à gauche, porteur d'une fonction amine libre, est le résidu N-terminal.

  • Le résidu le plus à droite, porteur d'une fonction carboxyle libre, est le résidu C-terminal.

  • Convention : Le résidu N-terminal est toujours placé à gauche.

2. La Liaison Peptidique

• La structure primaire des peptides est l'enchaînement des acides aminés.

• La liaison peptidique est une liaison de type amide, formée par condensation entre la fonction acide carboxylique d'un aa et la fonction α-aminée de l'aa suivant.

• Cette réaction est thermodynamiquement défavorisée mais se produit dans les ribosomes lors de la traduction.

• Elle relie les carbones α de deux acides aminés voisins.

• Effet de mésomérie : La liaison peptidique présente un caractère de double liaison partielle, dû à la délocalisation des électrons.

  • La double liaison peut être entre le carbone et l'oxygène du carbonyle, ou entre le carbone et l'azote.

  • Cette structure entraîne une hybridation de type sp2 pour les atomes de carbone et d'azote, immobilisant les trois atomes dans un même plan.

3. Structure de la Liaison Peptidique

• La liaison peptidique est une liaison covalente, mais sa longueur (1,32 Å) est intermédiaire entre une liaison simple C-N (1,45 Å) et une double liaison C=N.

• Cette longueur plus courte qu'une liaison simple confère une grande stabilité à la liaison peptidique.

• La liaison peptidique est plane et rigide.

4. Isomérie de la Liaison Peptidique

• Le caractère plan de la liaison peptidique limite sa géométrie à deux conformères : trans et cis.

• La conformation trans est la plus fréquente : les Cα sont de part et d'autre de la liaison peptidique. Elle est énergétiquement favorisée.

• La conformation cis est défavorisée en raison de l'encombrement stérique des chaînes latérales.

• Exception : Environ 10% des liaisons peptidiques impliquant un résidu proline sont en conformation cis. La proline est utile pour modifier l'orientation de la chaîne peptidique, notamment dans les coudes.

5. Les Angles de la Chaîne Peptidique

• Le plan de la liaison peptidique est rigide et interdit la rotation des atomes qui la constituent.

• Les seules liaisons dont l'orientation est libre sont celles qui entourent les carbones α (porteurs des radicaux R).

• Ces rotations sont définies par deux angles dièdres :

  • Phi (Φ) : angle de rotation autour de la liaison N-Cα.

  • Psi (Ψ) : angle de rotation autour de la liaison Cα-C (du carbonyle).

• Ces angles Φ et Ψ déterminent la structure secondaire de la protéine.

• Les valeurs possibles de Φ et Ψ sont contraintes par les interactions de Van Der Waals (répulsion entre atomes trop proches).

• Le diagramme de Ramachandran représente les combinaisons admissibles de ces angles, qui permettent la formation de liaisons hydrogène stabilisant la structure secondaire.

• Les chaînes latérales des acides aminés (sauf la glycine) peuvent apporter des contraintes stériques ou électrostatiques à la structure secondaire.

6. Détermination de la Composition Primaire des Peptides

L'objectif est de connaître la séquence des acides aminés dans un peptide ou une protéine.

Détermination de la composition en acides aminés (sans l'ordre)

• Hydrolyse acide :

  • Réalisée avec HCl 6N à 110°C pendant 25 à 72h.

  • Suivie d'une chromatographie pour identifier les acides aminés libres.

  • Technique sensible (pmole).

  • Limites :

    • Asparagine (Asn ; N) et Glutamine (Gln ; Q) sont désaminées en Aspartate (Asp ; D) et Glutamate (Glu ; E).

    • Le Tryptophane (Trp ; W) est souvent détruit.

    • Les ponts disulfures (S-S) sont rompus, altérant la cystéine.

• Hydrolyse alcaline :

  • Réalisée avec NaOH 2-4N à 100°C pendant 6h.

  • Permet de conserver le Tryptophane.

  • Inconvénients : Dégrade l'Arginine (Arg ; R), la Thréonine (Thr ; T) et la Cystéine (Cys ; C).

• Après hydrolyse, les acides aminés libres sont séparés par chromatographie échangeuse d'ions ou HPLC à phase inversée pour identification.

• L'aire sous le pic chromatographique est proportionnelle à la quantité d'acide aminé.

Séquençage des Peptides (détermination de l'ordre)

Consiste à déterminer le résidu N-terminal, le marquer, puis le cliver pour l'identifier, et répéter l'opération.

• Méthode de SANGER :

  1. Marquage du résidu N-terminal avec du DNF (Dinitrofluorobenzène), formant une liaison covalente stable avec la fonction NH₂ terminale.

  2. Hydrolyse acide puissante qui coupe toutes les liaisons peptidiques (mais pas la liaison DNF-NH₂).

  3. Identification de l'acide aminé N-terminal marqué par chromatographie.

  4. Inconvénient : L'hydrolyse complète empêche de répéter le cycle sur le même peptide.

• Méthode d'EDMAN :

  1. Marquage du résidu N-terminal avec du PTH (isothiocyanate de phényle), formant une liaison covalente stable.

  2. Hydrolyse acide douce qui clive uniquement la liaison peptidique entre le résidu N-terminal marqué et le reste du peptide.

  3. Obtention d'un phénylthiohydanthoïne-aminoacide (dérivé cyclique identifiable par chromatographie).

  4. Le peptide restant est intact mais amputé d'un seul acide aminé.

  5. Avantage : Le cycle peut être répété séquentiellement pour déterminer l'ordre de tous les acides aminés. Cette méthode a été automatisée.

Méthodes de Clivage Enzymatique des Peptides

La méthode d'Edman est limitée à des peptides d'environ 15-20 acides aminés. Pour les peptides plus longs, on les coupe en fragments plus petits.

• Peptidases : Enzymes qui clivent les liaisons peptidiques à des sites spécifiques.

• Exopeptidases : Coupent aux extrémités de la chaîne.

  • Aminopeptidases : Coupent entre le 1^er et le 2^e aa, libérant l'aa N-terminal.

  • Carboxypeptidases : Coupent entre l'avant-dernier et le dernier aa, libérant l'aa C-terminal.

  • Moins utiles pour réduire la taille des longs peptides.

• Endopeptidases : Coupent à l'intérieur de la chaîne peptidique. Très importantes pour le séquençage.

  • Trypsine : Hydrolyse les liaisons peptidiques en aval d'un résidu basique (après une Lysine (K) ou une Arginine (R)).

  • Chymotrypsine : Hydrolyse en aval d'un résidu aromatique (Tyrosine (Y), Tryptophane (W), Phénylalanine (F)) ou après Méthionine (M) ou Leucine (L).

  • Protéase staphylococcique : Hydrolyse en aval des résidus acides (Aspartate (E) et Glutamate (D)).

Méthodes de Clivage Chimique des Peptides

• Bromure de cyanogène (CNBr) : Clive spécifiquement toutes les liaisons peptidiques situées après une Méthionine.

• Les fragments obtenus peuvent ensuite être analysés par la méthode d'Edman.

• Ces méthodes s'appliquent aux peptides/protéines à chaîne unique sans ponts disulfures.

• Si plusieurs sous-unités : elles doivent être dissociées (ex: urée, chlorhydrate de guanidine) et isolées.

• Les ponts S-S doivent être réduits avant l'analyse.

7. Nomenclature des Peptides

Conventions pour représenter une séquence d'acides aminés :

• Les extrémités sont appelées N-terminal (fonction NH₂ libre) et C-terminal (fonction COOH libre).

• Par convention, le résidu N-terminal est placé à gauche et le C-terminal à droite.

• L'enchaînement est écrit de gauche à droite, numéroté à partir de l'extrémité N-terminale.

• Les acides aminés liés par des liaisons peptidiques sont appelés résidus et perdent une molécule d'eau (H₂O) par condensation.

• Pour indiquer un acide aminé lié, on ajoute le suffixe -yl (ex: glycinyl), sauf pour le résidu C-terminal.

• Si la séquence est incomplète, les acides aminés de position inconnue sont écrits entre parenthèses : Ex: Gly-Ala-Asp-(Leu, His, Ile, Val)-Glu-Phe.

Exemple : La vasopressine (ADH) est un nonapeptide avec un pont disulfure entre la cystéine N°1 (N-terminale) et la cystéine N°6.

8. Propriété Particulière Liée à la Liaison Peptidique

• Les peptides et protéines possèdent une bande d'absorption dans l'UV entre 180 et 230 nm, caractéristique de la liaison CO-NH (liaison peptidique). Cependant, le niveau d'absorption ne peut pas être directement corrélé à la quantité.

• Réaction du biuret :

  • En milieu alcalin, les peptides/protéines forment un complexe bleu-violet avec les ions cuivre II (Cu²⁺).

  • L'intensité de la couleur est proportionnelle à la concentration en protéines/peptides.

  • La coloration varie avec la nature des protéines, l'alcalinité, la concentration en sulfate de cuivre et la température.

  • Le maximum d'absorption varie avec le nombre de liaisons peptidiques :

    • Dipeptides : 650 nm.

    • Tripeptides : 580 nm.

    • Au-delà : environ 540 nm.

  • Méthode d'identification des protéines possible à 540 nm.

  • Seuil de quantification élevé (0,6 mg/L) : nécessite une solution assez concentrée.

9. Propriétés Ioniques des Peptides

• Le pHi (point isoélectrique) d'un peptide est le pH auquel sa charge globale est nulle.

• Le pHi dépend de la charge des groupes latéraux des acides aminés composants.

• Attention : Les pKa des fonctions au sein d'un peptide ne sont pas les mêmes que ceux des acides aminés isolés (interactions modifient ces valeurs).

• Méthode standard : Iso-électrofocalisation

  • Un gel avec un gradient de pH est préparé.

  • Les peptides sont déposés et un champ électrique est appliqué.

  • Les peptides migrent en fonction de leur charge jusqu'à atteindre la région du gel où le pH correspond à leur pHi. À ce point, leur charge est nulle et ils s'arrêtent de migrer.

  • Cette méthode permet de déterminer facilement le pHi d'un peptide.

10. Exemples de Peptides Biologiquement Actifs

Angiotensine II

• Octapeptide impliqué dans le maintien de la tension artérielle et la volémie plasmatique.

• Issue du clivage de l'angiotensine I par l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ECA).

• Actions :

  • Vasoconstriction (augmente la tension artérielle).

  • Sensation de soif (agit sur le système nerveux central).

  • Stimulation du cortex surrénal (sécrétion d'aldostérone).

• Récepteurs :

  • AT1R : Activation provoque la vasoconstriction. Cible des médicaments de type Sartan (anti-hypertenseurs).

  • AT2R : Sans effet sur la pression artérielle, rôle dans l'analgésie.

• Contexte SARS-CoV-2 : Le virus se fixe sur les récepteurs de l'ECA2 pour infecter les cellules humaines, expliquant des effets délétères (perte d'odorat, convulsions, inflammation cérébrale, arythmies, caillots sanguins).

Insuline

• Peptide constitué de deux chaînes polypeptidiques :

  • Chaîne A : 21 acides aminés.

  • Chaîne B : 30 acides aminés.

• Sécrétée par les cellules Bêta des îlots de Langerhans du pancréas lorsque le taux de glucose sanguin dépasse 6.10^-3 M.

• Effet hypoglycémiant : Favorise le retour de la glycémie à 5.10^-3 M.

• Mécanismes :

  • Favorise le stockage du glucose dans les cellules musculaires, adipeuses et le foie.

  • Bloque la libération de glucose par le foie.

  • En cas d'abondance alimentaire, stimule la conversion des glucides en acides gras pour le stockage.

• Synthèse :

  • Sécrétée sous forme de pré-pro-insuline (chaîne unique de 110 résidus).

  • Élimination du peptide signal (23 aa N-terminal) → formation de 3 ponts disulfures → pro-insuline.

  • Élimination du peptide C (fragment central) par une enzyme.

  • Clivage de l'extrémité C-terminale d'une des chaînes par une carboxypeptidase E → insuline mature active.

Glutathion

• Pseudo-tripeptide formé par la condensation d'acide glutamique, de cystéine et de glycine.

• Existe sous forme oxydée (G-S-S-G) et réduite (G-SH).

• Intervient dans le maintien du potentiel redox du cytoplasme cellulaire.

• Impliqué dans les réactions de détoxification et d'élimination des espèces réactives de l'oxygène.

• La fonction NH₂ de la cystéine se condense avec la fonction acide carboxylique en gamma de l'acide glutamique (liaison pseudo-peptidique).

• La fonction thiol (-SH) lui confère la plupart de ses propriétés biochimiques.

• Le glutathion réduit est le principal antioxydant cellulaire, protégeant des radicaux libres.

• Protège les cellules des polluants et métaux lourds (mercure, plomb) en réagissant avec leurs sels pour former une liaison soufre-métal forte, permettant leur excrétion.

Ocytocine

• Neuropeptide sécrété par l'hypothalamus et excrété par l'hypophyse postérieure.

• Agit principalement sur les muscles lisses de l'utérus et des glandes mammaires.

• Rôle chez l'humain dans la confiance, l'empathie, la générosité et la sexualité.

• Nonapeptide dont les deux résidus cystéine sont reliés par un pont disulfure.

• La fonction COOH terminale est bloquée par une fonction amide, conférant une résistance aux peptidases.