Principes de chromatographie liquide

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Ce document couvre les principes fondamentaux de la chromatographie liquide, incluant les phases mobiles et stationnaires, les mécanismes de séparation, les types de colonnes, et les paramètres clés comme le facteur de capacité, la sélectivité, la résolution et l'efficacité des colonnes.

La chromatographie est une technique de séparation puissante basée sur les différences d'affinité des composants d'un mélange entre deux phases : une phase stationnaire fixe et une phase mobile qui les entraîne. Ce document explore les types de chromatographie, les mécanismes de séparation et les grandeurs clés pour évaluer une séparation.

I. La Phase Mobile

La phase mobile est le fluide qui transporte les analytes à travers la phase stationnaire. Phase normal = phase stationnaire polaire. Donc la phase mobile = apolaire ou peu polaire.

Car si les deux phases on la même propriété les analytes vont pas avancer.

A. Nature de la Phase Mobile3r

Gaz (gaz vecteur):
- Utilisé en chromatographie en phase gazeuse (CPG).
- Ne sert qu'à entraîner les analytes.
- Le passage des analytes vers la phase mobile dépend de leur pression de vapeur (liée à la température), et non de leur solubilité.
Liquide (solvant ou éluant):
- Utilisé en chromatographie liquide (CL).
- A un double rôle :
  1. Entraîner les analytes à travers la colonne (vecteur).
  2. Solubiliser les analytes du mélange. Plus elle est solubiliser plus elle sortira vite. Elle préféra être en phase mobile que en phase stationnaire où elle est adsorbée.
- Un éluant est d'autant plus fort que sa polarité est proche de celle de la phase stationnaire.
- Peut être un solvant seul ou un mélange de solvants.

B. Polarité des Solvants (Éluants)

Les solvants peuvent être classés par polarité croissante, ce qui influence leur pouvoir d'élution :

Polarité	Solvants
FAIBLE pouvoir d'élution	Hexane
	Toluène
	Trichlorométhane
	Dichlorométhane
	Éther
	Acétate d'éthyle
FORT pouvoir d'élution	Acétonitrile
	Méthanol
	Eau

En phase normale, la phase mobile est souvent un mélange binaire apolaire ou peu polaire (ex: alcane comme l'hexane, et acétate d'éthyle).

II. La Phase Stationnaire (phase normale)

La phase stationnaire est le support fixe avec lequel les analytes interagissent.

A. Chromatographie d'Adsorption. Polarité et capacité à interagir avec les autres

Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est un adsorbant solide. Elle retient les analytes polaires (hydrophiles). La phase stationnaire est polaire à la surface on a des fonctions hydroxyle.

Caractérisation des adsorbants: Capacité d'adsorption, granulométrie, etc.
Adsorbants courants:
- Gel de silice (SiO₂)
- Alumine (Al₂O₃)

B. Chromatographie de Partage ( phase inverse la plus part du temps) polarité

Cette méthode implique deux phases liquides non miscibles : une phase mobile liquide (ou gazeuse) et une phase stationnaire liquide fixée (absorbée). La séparation est basée sur les différences de répartition des analytes entre ces deux fluides.

Quand on joue avec la non miscibilité de deux phases liquide.

Phase stationnaire: Phase liquide greffée sur un support solide(ex: silice). (Inerte)
- Elle doit être chimiquement inerte et ne pas réagir avec les analytes.
- Phase normale (NP): Phase stationnaire polaire (ex: groupements -NH₂, diol). Phase mobile (solvant) apolaire/peu polaire.
- Phase inverse (RP): Phase stationnaire apolaire (ex: groupements -C₁₈, -phényle, longue chaîne grasse). Phase mobile ( solvant ) polaire (Eau + solvants miscibles avec l'eau). C'est le type le plus courant.
Mécanisme de séparation: Les analytes se déplacent à des vitesses différentes selon leur répartition entre les deux phases.
- Plus la répartition dans la phase stationnaire est grande, plus la rétention est grande.
- Plus la répartition dans la phase mobile est grande, plus la rétention est courte.
- L'affinité de chaque analyte pour la phase stationnaire dépend de sa solubilité et de sa polarité dans cette phase.( les deux sont liés)
- Les forces impliquées sont les forces de Van der Waals, les liaisons hydrogène, les interactions hydrophobes, etc.

C. Chromatographie d'Échange d'Ions (CEI) échange de cation ou anion

La séparation est basée sur l'échange réversible d'ions entre les analytes chargés (ou ionisables) et les groupements fonctionnels ionisés de la résine de la phase stationnaire.

Paramètres de séparation: Charge des analytes, taille, porosité, nature chimique des groupements fonctionnels de la résine, pH et concentration en ions de la phase mobile.
Phase stationnaire: Résine avec des groupements ionisables.
- Les résines sont ionisées lorsque le pH de la solution tampon est inférieur (pour échangeurs cationiques faibles) ou supérieur (pour échangeurs anioniques faibles) au pKa de leurs groupements.
Exemples de résines:
- Échangeurs anioniques faibles: DEAE-polyoside (diéthylaminoéthyle).
- Échangeurs cationiques faibles: CM-polyoside (carboxyméthyle).
- Échangeurs anioniques forts: QAE-polyoside (quaternaire aminoéthyle).
- Échangeurs cationiques forts: SP-polyoside (sulfopropyle).
Processus d'élution: Après l'équilibrage et le dépôt de l'échantillon, l'élution est réalisée en modifiant le pH de la phase mobile ou en ajoutant un sel (NaCl par exemple) à concentration croissante. La phase mobile est généralement une solution aqueuse salée, souvent tamponnée.

D. Chromatographie d'Exclusion Stérique (SEC) exclu du fait de sa taille

La séparation s'effectue en fonction de la taille moléculaire des analytes en solution. Il y a une absence d'interaction entre l'analyte et la phase stationnaire. (Masse moléculaire en KDa)

Phase stationnaire: Gel (matrice poreuse constituée de particules sphériques et du liquide qu'elle contient).
- Gels permanents: Polymères organiques réticulés (polystyrène divinylbenzène) ou minéraux (silice).
- Gels hydratés: Polyosides (dextrane, agarose).
Mécanisme de séparation: Les grosses molécules ne peuvent pas pénétrer dans les pores de la phase stationnaire et sont éluées en premier. Les petites molécules pénètrent dans les pores et sont retenues plus longtemps.
- Les molécules sont éluées dans l'ordre inverse de leur taille (masse moléculaire et "volume").
Types de SEC:
- GFC (Gel Filtration Chromatography): Pour analytes polaires hydrosolubles.
- GPC (Gel Permeation Chromatography): Pour analytes organiques peu polaires.
Règle de polarité: En SEC, les analytes, la phase stationnaire et la phase mobile doivent avoir des polarités voisines pour que la séparation soit efficace.
Volumes d’elution clés:
- (Volume d'exclusion totale / Volume interstitiel) volume mort: Volume de phase mobile à l'extérieur de la phase stationnaire. Mesuré avec une grosse molécule (non retenue). Le volume de phase mobile nécessaire (temps) pour élire des grosses molécules (sortent en premier).
- (Volume des pores): Volume de phase mobile à l'intérieur de la phase stationnaire.
- (Volume total): Volume de phase mobile dans la colonne (). Mesuré avec une petite molécule (fortement retenue). Pour chasser toutes les molécules.
- La relation est .
  au delà d’une certaine taille ils ne peuvent plus rentrer dans un port(canaux) la limite d’exclusion donné en Dalton.
Gamme de rétention: Chaque type de gel a une gamme spécifique de rétention et d'exclusion (ex: Sephacryl S-100 pour 10³ à 10⁵ Da).
deux molécules qui n’ont pas la même masses vont sortir à des temps différents. Il est aussi question de volume.

E. Chromatographie d'Affinité

Cette technique utilise une interaction biologique spécifique pour la séparation. La séparation repose sur la fixation spécifique et réversible d'un analyte à un ligand lié à la matrice de la phase stationnaire. Retenir des analytes spécifiques dites ciblés.

Ligands (ou effecteurs): Molécules capables de former des complexes stables avec l'analyte cible.
Exemples de couples:
- Substrat / Enzyme
- Anticorps / Antigène

III. Grandeurs de Rétention et de Résolution

Ces grandeurs permettent de caractériser et d'optimiser la qualité d'une séparation chromatographique.

A. Volume et Temps de Rétention

L’échelle qu’on a en abscisse.
Volume de rétention (): Volume de phase mobile nécessaire pour éluer un analyte. $V_r = t_r \times D" data-type="inline-math">t_rD$ $V_{r} = t_{r} \times D " d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an >< s p an d a t a - l a t e x = " o \overset{u}{ˋ} " d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an > t_{r} < s p an d a t a - l a t e x = " es tl e t e m p s d er \overset{e}{ˊ} t e n t i o n (e n so u min) e t " d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an > D$ est le débit de la phase mobile (en mL/s ou mL/min).
Temps de rétention (): Temps pendant lequel un analyte reste dans la colonne. Pour les composés non retenus, on parle de temps mort () et de volume mort ().
Temps de rétention corrigé (réduit) (): $t_r' = t_r - t_0" data-type="inline-math">$ $t_{r}^{'} = t_{r} - t_{0} " d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an >$
Facteurs influençant et : Nature de la phase stationnaire, nature de la phase mobile, débit de la phase mobile, longueur de la colonne.

B. Facteur de Capacité (k')

Le facteur de capacité est une mesure de la rétention d'un analyte par la phase stationnaire.

Définition: Rapport de la quantité d'analyte dans la phase stationnaire à la quantité d'analyte dans la phase mobile. $k' = \left(C_s V_s\right) / \left(C_m V_m\right) = K \times \left(V_s / V_m\right)" data-type="inline-math">C_s, V_sC_m, V_mK$ $k^{'} = (C_{s} V_{s}) / (C_{m} V_{m}) = K \times (V_{s} / V_{m}) " d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an >< s p an d a t a - l a t e x = " o \overset{u}{ˋ} " d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an > C_{s}, V_{s} < s p an d a t a - l a t e x = " so n tl a co n ce n t r a t i o n e tl e v o l u m e d e l a p ha ses t a t i o nnai re, e t " d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an > C_{m}, V_{m} < s p an d a t a - l a t e x = " ce ux d e l a p ha se m o bi l e ." d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an > K$ est le coefficient de partage.
Définition alternative: Rapport du temps que l'analyte passe dans la phase stationnaire sur le temps passé dans la phase mobile. $k' = (t_r - t_0) / t_0 \quad \text{ou} \quad k' = t_r' / t_0" data-type="inline-math">$ $k^{'} = (t_{r} - t_{0}) / t_{0} ou k^{'} = t_{r}^{'} / t_{0} " d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an >$
Propriétés:
- Paramètre sans dimension.
- Ne dépend ni du débit ni de la longueur de la colonne.
- Plus k' est grand, plus l'analyte passe de temps dans la phase stationnaire.
Optimalité:
- Quand k' ≈ 1 → rétention insuffisante.
- Quand k' > 30 → rétention trop importante.
- Quand 2 < k' < 10 → rétention optimale.

C. Facteur de Sélectivité ()

Le facteur de sélectivité mesure la capacité de la colonne à séparer deux analytes différents.

Définition: Rapport des facteurs de capacité des deux analytes (composés 1 et 2) que l'on souhaite séparer. \alpha = k_2' / k_1' \quad \text{ou} \quad \alpha = (t_{r2} - t_0) / (t_{r1} - t_0) \quad \text{ou} \quad \alpha = t_{r2}' / t_{r1}'" data-type="inline-math">k_2' > k_1't_{r2} > t_{r1}\alpha \geq 1).
Propriétés:
- Paramètre sans dimension.
- signifie que les pics ne sont pas séparés.
- Une valeur de indique une bonne séparation.
- Plus est grand, plus la séparation entre deux pics est importante.
- est un indicateur de la rétention, mais ne tient pas compte de l'efficacité de la colonne ou de la largeur des pics.

D. Résolution (R ou Rₛ)

La résolution est un paramètre crucial qui quantifie la qualité de la séparation entre deux pics adjacents.

Avantages: La résolution est souvent préférée au facteur de sélectivité car elle tient compte de l'efficacité de la colonne et de la largeur des pics.
Déterminants:
1. La distance séparant les sommets de deux pics ().
2. La largeur des pics à la base ().
Formules:
- En termes de volume de rétention: $R = 2 \frac {(V_{r2} - V_{r1})}{(\omega_2 + \omega_1)}" data-type="inline-math">$ $R = 2 \frac{( V _{r 2} - V _{r 1} )}{( ω _{2} + ω _{1} )} " d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an >$
- En termes de temps de rétention: $R = 2 \frac {(t_{r2} - t_{r1})}{(\omega_2 + \omega_1)}" data-type="inline-math">$ $R = 2 \frac{( t _{r 2} - t _{r 1} )}{( ω _{2} + ω _{1} )} " d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an >$
Interprétation:
- Si R < 0,80 → séparation généralement insuffisante.
- Si R = 1,00 → séparation pratiquement complète (environ 2% de recouvrement).
- Si R = 1,50 → séparation complète.
- Si R >> 1,00 → séparation peu améliorée par rapport à R ≈ 1,00 (signifie une perte de temps et de solvant).

E. L'Efficacité (Nombre de Plateaux Théoriques N et HEPT)

L'efficacité caractérise l'élargissement des pics et la performance de la colonne.

Nombre de plateaux théoriques (N): Représente le nombre de fois où un équilibre de partage s'établit dans la colonne. Plus N est grand, meilleure est la séparation.
- N est indépendant de la rétention des analytes, mais dépend de la longueur de la colonne.
- Formules de N (les pics sont supposés gaussiens): $N = 16 \left(\frac {t_r}{\omega}\right)^2 \quad \text{ou} \quad N = \left(\frac {t_r}{\sigma}\right)^2 \quad \text{ou} \quad N = 5,54 \left(\frac {t_r}{\delta}\right)^2" data-type="inline-math">\omega\sigma\delta\omega_{1/2}$ $N = 16 (\frac{t _{r}}{ω})^{2} ou N = (\frac{t _{r}}{σ})^{2} ou N = 5, 54 (\frac{t _{r}}{δ})^{2} " d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an >< s p an d a t a - l a t e x = " o \overset{u}{ˋ} " d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an > ω < s p an d a t a - l a t e x = " es tl a l a r g e u r d u p i c \overset{a}{ˋ} l aba se, " d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an > σ < s p an d a t a - l a t e x = " l^{'} \overset{e}{ˊ} c a r t - t y p e d e l a g a u ss i e nn e, e t " d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an > δ < s p an d a t a - l a t e x = " o u " d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an > ω_{1/2}$ la largeur du pic à mi-hauteur.
Hauteur Équivalente à un Plateau Théorique (HEPT ou H):
Permet de comparer l'efficacité de colonnes de différentes longueurs.
$\text{HEPT} = L / N" data-type="inline-math">$ $HEPT = L / N " d a t a - t y p e = " in l in e - ma t h " >< / s p an >$ où L est la longueur de la colonne.
- Une colonne efficace présente une HEPT faible (quelques microns pour les colonnes capillaires en CPG).

IV. Références

<a href="[src:3ee6d628-f74c-4e08-b63a-3bdeca945ec2]">Source 1</a>
<a href="[src:b67f82c3-1d0d-4327-8901-f070529dah]">Source 2</a>
<a href="[src:8152129d-b16b-49f8-b04e-b9c5f2b6a035]">Source 3</a>

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