Introduction à la microscopie et ses applications

Maniement du Stéréomicroscope et du Microscope

Cette section détaille l'utilisation et les caractéristiques des stéréomicroscopes et microscopes, outils essentiels en biologie pour l'observation d'échantillons.

Stéréomicroscope

Le stéréomicroscope est composé de deux microscopes indépendants et convergents, offrant à chaque œil une image légèrement différente de l'objet. Cette particularité permet au cerveau de générer une sensation de relief, similaire à la vision à l'œil nu.

• Profondeur de champ: Mesure de l'épaisseur de la tranche de l'objet qui reste nette. Elle diminue avec l'augmentation du grossissement.
• Grossissement: Généralement faible (ex: 13x à 56x), il est ajusté par permutation de lentilles internes.
• Image: Redressée grâce à un jeu de prismes.
• Éclairage: Deux types disponibles:
  • Éclairage épiscopique (par le dessus): Pour les objets opaques.
  • Éclairage diascopique (par le dessous): Pour les objets transparents.
  • Combinaison des deux pour les objets partiellement transparents.
• Utilisation: Adapté à l'examen d'objets transparents et opaques.

Après usage, éteindre, nettoyer, couvrir et ranger le stéréomicroscope. Toujours débrancher en tirant sur la fiche, jamais sur le fil.

Stéréomicroscope Leica EZ4

• Base ou statif: Support de l'appareil.
• Poignée de transport: Pour déplacer l'appareil.
• Fiche pour le cordon d'alimentation: Pour le branchement électrique.
• Réglage de la distance inter-pupillaire: Pour adapter l'écartement des oculaires aux yeux de l'observateur.
• Mise au point:
  1. Commencer par le plus petit grossissement.
  2. Ajuster la hauteur de l'appareil pour une mise au point rapide (distance de travail d'environ 100 mm).
  3. Passer au plus fort grossissement et affiner la mise au point.

Microscope

Le microscope optique, tel que le Leica DM500, permet l'observation d'échantillons à des grossissements plus élevés.

Partie mécanique

• Potence: Partie structurelle avec une poignée pour le transport.
• Platine: Support de l'échantillon, mobile verticalement.
  • Vis macrométrique (mouvement rapide): Pour le réglage grossier de la hauteur.
  • Vis micrométrique (mouvement lent): Pour l'ajustement fin de la hauteur.
• Centrage de la platine: Opération délicate pour aligner l'axe optique.

Partie optique

• Axe optique: Droite sur laquelle sont centrés la source lumineuse, les lentilles et l'œil.
• Boîte à prismes: Coude l'axe optique et redresse l'image (ne doit jamais être ouverte).
• Éclairage: LED, intensité lumineuse ajustable. Toujours commencer par la valeur la plus basse.
• Condenseur: Système de lentilles qui concentre le faisceau lumineux sur l'objet.
  • Diaphragme-iris: Ajustable pour contrôler la quantité de lumière en fonction de l'objectif.
• Objectifs: Montés sur un revolver ou tourelle.
  • Projetent une image réelle, agrandie et tournée de 180°.
  • Exemples: 4x (faible), 10x (moyen), 40x (fort).
  • La lentille frontale est la plus proche de l'objet. La distance frontale est la distance entre l'objet et cette lentille une fois la mise au point faite.
• Oculaire: Système de lentilles pour observer l'image formée par l'objectif.
• Grossissement total: Produit du grossissement de l'oculaire et de l'objectif.
• Pouvoir séparateur (limite de résolution): Mesure la distance minimale entre deux objets perçus comme distincts. Maximum de 0,2 μm en lumière visible.

Préparation des échantillons

• Préparation microscopique: Échantillon sur une lame (porte-objet) recouvert d'une lamelle (couvre-objet).
• Fonctions de la lamelle:
  • Rend la surface plane.
  • Protège la préparation (abrasion, oxydation, évaporation).
  • Protège la lentille frontale.
• La lamelle doit toujours être vers le haut pour l'observation à fort grossissement.

Position de l'observateur

• Ajuster la hauteur du siège et la distance interoculaire (interpupillaire).

Réglage du microscope

• Champ: Plage lumineuse observée à l'oculaire. Centrer l'objet est crucial car l'image est inversée (180°).
• Profondeur de champ: Diminue avec l'augmentation du grossissement.
• Toujours avoir la main sur la mise au point lors de l'observation.

Comment observer une lame au microscope ?

1. Placer la lame sur la platine, lamelle vers le haut, et la fixer avec les valets.
2. Centrer l'objet avec la commande X/Y.
3. Faire la mise au point avec l'objectif à faible grossissement (vérifier l'orientation de la lame si l'image est floue).
4. Passer à un objectif plus fort, en s'assurant que l'objet est centré. Affiner la mise au point avec la vis micrométrique.

Attention: Éviter tout contact entre la lamelle et l'objectif, surtout aux forts grossissements, pour ne pas endommager la préparation ou l'objectif.

Nettoyage du microscope

• Maintenir toutes les parties propres. Essuyer immédiatement tout liquide.
• Nettoyer régulièrement la lentille frontale de l'objectif et la lentille supérieure de l'oculaire avec un mouchoir neuf en papier, par mouvements circulaires.
• Ne jamais démonter l'optique.

Déplacement du microscope

• Après usage, couvrir le microscope avec sa housse.
• Ranger l'objectif faible dans l'axe et remonter la platine.
• Transporter à deux mains, en le saisissant par la potence, sans l'incliner.
• Enrouler le cordon d'alimentation.

Microscope Leica DM500

• Oculaires: 10x
• Objectifs: 4x, 10x, 40x
• Cordon d'alimentation: Utiliser l'enrouleur.
• Interrupteur marche/arrêt.
• Déplacement: Toujours à deux mains (poignée au dos et gorge en façade).
• Réglage de l'intensité lumineuse: Commencer par la valeur la plus basse.
• Utilisation des oculaires: Régler l'écart inter-pupillaire.
• Utilisation du condenseur: Tourner la bague moletée pour aligner le trait sur le grossissement utilisé.
• Préparatifs avant l'observation: Placer la lame sur la platine, la faire glisser jusqu'à l'arrêt.
• Mouvement de la lame: Utiliser la commande X/Y de la platine.
• Focalisation:
  1. Tourner la tourelle pour l'objectif le plus faible.
  2. Première mise au point avec la vis macrométrique.
  3. Affiner avec la vis micrométrique.
  4. Régler l'intensité lumineuse.

Séance 1: Introduction à la Microscopie

Cette séance vise à mettre en pratique les connaissances théoriques sur le maniement des microscopes à travers l'observation de diverses préparations.

1. Évaluation des paramètres de microscopie

Utilisation d'une préparation de papier millimétré (carrés de 1 mm, soit 1000 μm) pour évaluer les paramètres.

1.1. Stéréomicroscope

• Brancher et observer les différentes parties (oculaires, objectifs, vis de mise au point, grossissement, éclairage, platine).
• Observer la préparation de papier millimétré aux petits et gros grossissements.
• Constater que l'image est à l'endroit.
• Compléter le tableau suivant sur le rapport:

  Oculaire	Objectifs	Grossissement total	Diamètre du champ (avec calculs et unités)	Distance frontale

• Pour le diamètre du champ, compter les carrés le long du diamètre et convertir en μm.

1.2. Microscope

• Brancher et observer les différentes parties (statif, potence, source lumineuse, oculaire, revolver et objectifs, vis de mise au point, platine porte-objet, condenseur, diaphragme).
• Observer la préparation aux trois grossissements.
• Compléter le tableau suivant sur le rapport:

  Oculaire	Objectifs	Grossissement total	Diamètre du champ (avec calculs et unités)	Distance frontale	Profondeur de champ (en tours de vis μ)

• Estimer la profondeur de champ en évaluant le nombre de tours de la vis micrométrique.
• Indiquer comment varient la distance frontale et la profondeur de champ en fonction de l'objectif utilisé.

2. Frottis sanguins

Les lames sont des préparations permanentes, colorées, à observer directement à sec.

• Confection d'un frottis sanguin (déjà fait):
  1. Déposer une goutte de sang sur une lame, approcher une seconde lame à 30°-40°.
  2. La goutte s'étend par capillarité.
  3. Déplacer la lame pour étendre la goutte en couche monocellulaire.
• Après séchage, le frottis est coloré au May-Grünwald-Giemsa et recouvert d'une lamelle.
• Les éléments cellulaires acides sont colorés en bleu, basiques en orange-rouge vif, neutres en rose beige.

Quel est l'objectif le plus approprié pour observer un globule rouge humain (environ 7 μm de diamètre) ?

2.1. Frottis sanguins de non-mammifères (ex: poisson ou amphibien)

• Mettre au point successivement aux trois objectifs.
• Dessiner 2-3 globules rouges au gros grossissement, dont un légendé (membrane plasmique, cytoplasme, enveloppe nucléaire, noyau).
• Les globules blancs sont difficilement identifiables mais peuvent être observés.

2.2. Frottis sanguins de mammifères (ex: humain)

Le sang humain est composé de plasma et de cellules sanguines:

• Globules rouges (GR) ou érythrocytes: Transport d'O2 et de CO2.
  • Forme de disque biconcave, élastique.
  • Dépourvus d'organites, riches en hémoglobine.
  • Les jeunes GR sont des réticulocytes, avec des restes d'ARN.
• Globules blancs (GB) ou leucocytes: Défense immunitaire.
  • Distingués par l'aspect du noyau et la présence de granulations.
  • Types de leucocytes:
    • Granulocytes (polynucléaires): Nombreuses granulations, noyau polylobé.
      • Neutrophiles (40-70%): Cytoplasme clair, noyau 3-5 lobes. Phagocytent bactéries et débris.
      • Éosinophiles (2-6%): Noyau bilobé, granulations rouge orangé. Luttent contre parasites, rôle dans allergies/inflammation.
      • Basophiles (0.5-1%): Noyau peu segmenté, granulations imposantes. Sécrètent des substances (héparine, histamines) pour les réactions d'hypersensibilité.
    • Agranulocytes (mononucléaires):
      • Lymphocytes (20-40%): Taille d'un GR, noyau occupant presque toute la cellule. Rôle primordial dans l'immunité (B pour humorale, T pour cellulaire).
      • Monocytes (4-10%): Les plus grandes cellules, cytoplasme bleu gris, noyau réniforme. Se différencient en phagocytes (macrophages, cellules microgliales, ostéoclastes).
• Plaquettes sanguines ou thrombocytes: Rôle dans la coagulation.
  • Petits fragments de cellule sans noyau, produits par les mégacaryocytes dans la moelle osseuse.
  • S'agrègent pour colmater les lésions et former des caillots.

• Mettre au point successivement aux trois objectifs.
• Repérer et dessiner 2-3 GR (un légendé), ainsi que 3 GB (un neutrophile, un lymphocyte, et au choix un monocyte, éosinophile ou basophile).
• Représenter les plaquettes si visibles. Noter la différence de taille.
• Indiquer 3 différences majeures entre les GR de mammifères et de non-mammifères.

Pourquoi, après un don de sang, est-il conseillé de prendre du fer ?

2.3. Frottis sanguins de rats parasités

Observation de parasites unicellulaires (protistes) dans le sang.

• Trypanosome:
  • Trypanosoma brucei brucei: Semblable aux agents de la maladie du sommeil.
  • Protistes zooflagellés fusiformes, se déplaçant avec un flagelle.
  • Caractérisés par un kinétoplaste (mitochondrie géante avec ADN condensé).
  • Transmis par la mouche tsé-tsé (Glossina).
  • Provoque fièvre, fatigue, douleurs articulaires, atteintes du système nerveux central.
• Plasmodium:
  • Plasmodium berghei: Semblable aux agents du paludisme (malaria).
  • Envahissent les cellules du foie, puis les GR où ils se multiplient (formes diverses: anneau, bague, bande équatoriale).
  • Transmis par la femelle du moustique Anopheles.
  • Provoque fièvres élevées, troubles neurologiques, anémie sévère, hémorragies.

• Représenter quelques parasites dans ou parmi les GR.
• Pour Trypanosoma, légender la membrane ondulante, le flagelle, le noyau, le kinétoplaste.
• Préciser le parasite, la maladie et le vecteur.

3. La paramécie

3.1. Introduction

La paramécie est un protiste cilié holotriche, unicellulaire complexe, vivant en eau douce. Elle se nourrit d'infusions végétales et peut atteindre une taille de 70 à 350 μm.

• Corps: Fusiforme, quatre fois plus long que large, avec un péristome (dépression en gouttière) sur le côté ventral.
• Mouvement: Nage en tournant sur elle-même (mouvement hélicoïdal).
• Pellicule: Membrane limitant le corps, perméable aux liquides et gaz.
• Cytoplasme: Divisé en ectoplasme (externe, empêche les déformations) et endoplasme (interne, granuleux, contient inclusions, vacuoles et noyaux).

3.2. Observations générales

• Placer une goutte de culture sur une lame, recouvrir d'une lamelle.
• Observer le mouvement des protozoaires. Les ralentir en absorbant l'excès d'eau.
• Observer aux différents grossissements, notamment près des débris ou bulles d'air.

3.3. Observations des organites

• Ciliature: Environ 25 000 cils vibratiles pour la locomotion et l'alimentation (créent des tourbillons).
• Vacuoles pulsatiles: Deux vacuoles (une à chaque extrémité), rôle excréteur et osmorégulateur.
  • Composées d'une vésicule centrale et de canalicules.
  • Cycle: dilatation des canalicules, déversement dans la vésicule (diastole), contraction de la vésicule (systole) pour expulser le contenu.
• Vacuoles digestives: Se forment au fond du cytopharynx après ingestion de particules alimentaires via le péristome et le cytostome. Fusionnent avec les lysosomes.
  • Observation facilitée par des levures colorées au rouge neutre.
  • Leur couleur varie selon le pH (jaune/orangé à pH acide, rouge sombre à pH basique).
  • Les résidus non digérés sont évacués par le cytoprocte.
• Noyaux: Double appareil nucléaire:
  • Macronoyau: Volumineux, polyploïde, contrôle les fonctions trophiques.
  • Micronoyau: Réduit, sphérique, diploïde, assure les fonctions sexuelles.
• Trichocystes: Petites capsules ovoïdes dans l'ectoplasme. Libèrent un filament protéinique en cas de menace, servant à la défense ou à la capture de proies.

• Faire un grand dessin (une page) de la paramécie, incluant: ciliature, ectoplasme, endoplasme, pellicule, macronoyau (et micronoyau en pointillé), vacuoles digestives, vacuoles pulsatiles (avec vésicule centrale et canalicules, état en diastole/systole), inclusions cytoplasmiques, péristome (accès au cytostome et cytopharynx), trichocystes.
• Répondre aux questions sur les vacuoles pulsatiles (simultanées/alternatives, emplacement constant/non).

4. Épiderme d’écaille de bulbe d'oignon

L'oignon est une plante monocotylédone, son bulbe est un bourgeon volumineux composé d'écailles charnues (réserves) et protectrices.

4.1. Technique

1. Déposer une goutte d'eau sur une lame.
2. Prélever une écaille d'oignon.
3. Faire deux incisions transversales parallèles dans l'épiderme externe.
4. Détacher un lambeau fin d'épiderme.
5. L'étaler dans la goutte d'eau, appuyer légèrement.
6. Couvrir d'une lamelle en biais, éviter les bulles d'air.
7. Essuyer l'excédent de liquide.

• Observer aux moyens et gros grossissements.

4.2. Observation vitale dans l’eau

Observer en diaphragmant fortement en raison du faible contraste.

1. Parois de cellulose: Délimitent de grandes cellules polyédriques allongées. La lamelle de pectines (ciment intercellulaire) et les parois apparaissent comme un ensemble unique. Les méats intercellulaires (petits espaces triangulaires) permettent la circulation de l'air.
2. Vacuole: Grande cavité (apparemment vide) remplie de suc cellulaire. Contient de l'eau, des sels minéraux, des sucres et parfois des pigments (anthocyaniques dans l'oignon rouge, donnant une coloration rose violet). Délimitée par le tonoplaste.
3. Cytoplasme: Incolore et granuleux, forme une fine couche appliquée contre la membrane plasmique. Difficilement visible en raison de la turgescence.
4. Noyau: Incolore, plus réfringent que le cytoplasme. Contient deux nucléoles. Baigne dans le cytoplasme, ne touche pas la paroi.

• Faire un grand dessin d'une seule cellule (400x), incluant les zones de contact avec les cellules adjacentes. Représenter paroi, membrane plasmique, vacuole, cytoplasme, noyau. Dessiner les structures non visibles en pointillés.

4.3. Expérience de plasmolyse

La turgescence est l'état de rigidité d'une cellule végétale due à la pression interne sur sa paroi. La plasmolyse est la perte d'eau par la cellule dans un milieu hypertonique, entraînant une rétraction du cytoplasme et un décollement de la membrane plasmique de la paroi.

• Phénomène: Dans un milieu hypertonique (ex: solution NaCl 10%), l'eau sort de la cellule par osmose.
• Conséquences: Diminution du volume vacuolaire et cytoplasmique, décollement de la membrane plasmique. Des plasmodesmes (canalicules intercellulaires) peuvent être visibles sous forme de filaments.
• La plasmolyse est réversible jusqu'à un certain seuil, au-delà duquel elle entraîne la mort cellulaire.

4.3.1. Technique

1. Appliquer une goutte de solution NaCl 10% sur un bord de la lamelle.
2. Aspirer l'excédent de liquide du côté opposé avec du papier absorbant.
3. Observer la plasmolyse.

• Dessiner une cellule à un stade avancé de plasmolyse, précisant la paroi de cellulose, la membrane cytoplasmique, le cytoplasme, le noyau, la vacuole, le tonoplaste et l'emplacement des plasmodesmes.
• Répondre aux questions:
  • Qu'y a-t-il entre la paroi et la membrane ?
  • Expliquer le phénomène de plasmolyse.
  • Constater une modification de la coloration des vacuoles et l'expliquer.

5. Parenchyme chlorophyllien de la feuille d’elodea

L'élodée est une plante aquatique dicotylédone, aux feuilles verticillées par trois.

5.1. Technique

1. Saisir la pointe d'une feuille avec une pince fine.
2. L'arracher délicatement vers le bas.
3. L'étaler sur une lame dans une goutte d'eau, face supérieure vers le haut.
4. Couvrir d'une lamelle.

5.2. Observations

Observer les cellules à la base de la feuille, près de la nervure.

• Paroi de cellulose: Délimite les cellules polyédriques allongées.
• Chloroplastes: Ovoïdes, de couleur verte.
• Cytoplasme et noyau: Peu visibles, sauf si la cellule est en mauvais état physiologique.
• Cyclose: Mouvement de l'écoulement dirigé du cytoplasme autour de la vacuole centrale, entraînant les organites. Sa vitesse dépend de la température.

• Dessiner 1 ou 2 cellules avec leurs chloroplastes, paroi, membrane, vacuole.
• Indiquer le mouvement des chloroplastes et expliquer la cyclose et son rôle.

6. Parenchyme amylifère de la pomme de terre

La pomme de terre est un tubercule (renflement souterrain de la tige) de l'espèce Solanum tuberosum, dicotylédone. Il stocke l'amidon.

6.1. Technique pour l’observation du parenchyme

1. Découper des tranches fines de pomme de terre avec un scalpel.
2. Choisir la tranche la plus fine et la monter entre lame et lamelle.

6.2. Observations

• Grandes cellules polyédriques avec des méats.
• Les cellules intactes contiennent des grains d'amidon de différentes tailles.
• Cytoplasme et noyau peu visibles, vacuole réduite.
• Les grains d'amidon présentent des stries concentriques autour d'un hile (point sombre).

• Dessiner 1 ou 2 cellules avec leurs grains d'amidon.
• Détailler un grain d'amidon avec ses stries concentriques et le hile.

7. Xylème de la feuille de poireau

Le poireau (Allium porum) est une monocotylédone, avec une structure de bulbe allongée.

• Dans la partie vert foncé des feuilles, entre les épidermes, se trouvent des parenchymes et des faisceaux vasculaires:
  • Xylème: Conduit la sève brute. Composé de vaisseaux ligneux (cellules mortes lignifiées).
  • Phloème: Conduit la sève élaborée.
• Types de vaisseaux xylémiens dans la feuille de poireau:
  • Vaisseaux annelés: Épaississements en anneaux distincts, présents chez la jeune feuille.
  • Vaisseaux spiralés: Épaississements en spire, présents chez la feuille plus âgée, plus gros.