CULTURE CELLULAIRE

La culture cellulaire est un ensemble de techniquespermettant de faire croître des cellules en dehors de leur organisme ou milieu d'origine (ex vivo) à des fins d'expérimentation scientifique, de diagnostic ou médicales.

I. Intérêts de la culture cellulaire

1. Pourquoi cultiver des cellules ?

La culture cellulaire est essentielle en recherche fondamentale pour étudier les mécanismes cellulaires sans l'interférence d'autres molécules de l'organisme, comme les hormones. Cela permet de comprendre les comportements cellulaires propres et de développer des cibles thérapeutiques.

• En médecine:

  • Autogreffes: Prélèvement de cellules d'un patient, culture pour prolifération, puis greffe sur le même patient (ex: grands brûlés, cellules sanguines).

  • Ingénierie cellulaire et tissulaire: Recréer des tissus (peau, néo-vaisseaux) pour remplacer des zones lésées.

  • Dépistage de maladies génétiques (études chromosomiques): Caryotype fœtal pour détecter des anomalies chromosomiques (ex: trisomie 21) à partir de cellules cultivées.

  • Thérapie génique ou cellulaire: Utilisation de cellules souches capables de se redifférencier en différents types cellulaires.

  • Fécondation in vitro (FIV): Fécondation et culture d'ovocytes in vitro avant implantation.

• En industrie pharmaceutique:

  • Études toxicologiques et pharmacologiques: Test in vitro de nouvelles molécules thérapeutiques avant les études in vivo.

  • Production de substances à usage thérapeutique: Hormones de croissance, cytokines, anticorps, vaccins.

II. Qu’est-ce que la culture cellulaire ?

1. Définition

La culture cellulaire regroupe des techniques qui permettent la croissance de cellules ex vivo pour l'expérimentation, le diagnostic ou des applications médicales.

Il existe plusieurs types de cultures cellulaires selon les cellules utilisées:

• Cellules adhérentes: Nécessitent un support pour leur croissance (ex: cellules de tissus solides).

• Cellules en suspension: Poussent librement dans un milieu liquide (ex: cellules sanguines).

• Cultures primaires: Directement issues d'un prélèvement.

• Cultures secondaires: Cultures issues de repiquages de cultures primaires.

• Lignées cellulaires: Cellules immortalisées avec une capacité de division illimitée.

Les cellules peuvent provenir de liquides biologiques (sang) ou de tissus solides nécessitant une digestion.

2. Avantages et inconvénients

III. Les sources et obtention des cellules

1. Cellules en suspension :cellules isolées à partir d’un liquide

Les cellules en suspension ne nécessitent pas de support pour leur croissance et se multiplient dans un milieu liquide.

• Origine des cellules: Liquides biologiques (sang, liquide amniotique), moelle osseuse, tumeursliquides.

• Matériel de culture: Bouteilles, cônes, flasques.

A. Principe d’isolation de cellules primaires issues de tissus liquides : centrifugation sur gradient de densité

Cette méthode sépare les cellules en fonction de leur densité.

Exemple: Obtention de PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells) à partir de sang.

1. Prélèvement de sang, mélangé avec du PBS.

2. Dépôt sur une matrice de Ficoll(gel de densité spécifique).

3. Centrifugation pour séparer les phases:

   • Phase supérieure: Plasma.

   • Phase intermédiaire: PBMCs (lymphocytes B et T, monocytes, cellules NK).

   • Phase sous-jacente au Ficoll: Érythrocytes et polymorphonucléaires.

2. Cellules adhérentes : issues d’un tissu ou d’un organe

Les cellules adhérentes se multiplient uniquement lorsqu'elles adhèrent à un support.Elles proviennent généralement de tissus qui sont des ensembles de cellules enchâssées dans une matrice extracellulaire (MEC).

A. Principe d’isolation de cellules issues de tissus solides

• Isolation par dissection/digestion:

  • Digestion enzymatique: Utilisation d'enzymes comme la collagénase ou l'élastase pour dégrader la MEC et libérer les cellules.

  • Dissociation mécanique: Broyage du tissu dans une seringue pour obtenir de plus petits fragments.

  • Dissection: Sectionnement grossier du tissu dans une boîte de pétri avant désagrégation.

Une fois isolées, les cellules peuvent être mises en culture de différentes manières:

• Culture primaire dissociée: Cellules remises en culture directement après leur isolement du tissu.

• Culture primaire d’explant: Petits morceaux de tissu (explants) sont cultivés, permettant aux cellules de s'échapper du tissu et de proliférer.

• Culture organotypique/histiotypique: Culture de morceaux de tissus entiers ou d'organes, souvent avec un interface gaz-liquide pour recréer un environnement favorable.

Note: Les protocoles varient grandement et sont souvent combinés pour s'adapter au type de tissu.Les cellules adhérentes cultivées en flasque forment une monocouche en 2D. Des matrices d'hydrogel 3D peuvent être utilisées pour se rapprocher du milieu in vivo.

IV. Purification des cellules

La purification estessentielle pour obtenir des cultures pures composées d'un seul type cellulaire.

Méthodes de tri:

• Tri physique:

  • Centrifugation sur gradient (ex: PBMCs).

  • Cytométrie en flux.

  • Ultracentrifugation (centrifugation à très haute vitesse).

• Tri par avantage prolifératif: Sélection de cellules capables de survivre et de proliférer sans facteurs de croissance ou sérum spécifiques.

• Tri par adhérence: Exploitation des différences d'adhérence entre types cellulaires (ex: monocytes vs. macrophages, cellules musculaires lisses vs. endothéliales).

• Tri par méthode immunologique: Utilisation d'anticorps dirigés contre des antigènes spécifiques des cellules, couplés à des billes magnétiques ou des fluorochromes.

1. Exemple de sélection des Lymphocytes B (LB)

A. Centrifugation sur gradient

Principe similaire à l'isolement des PBMCs, où la densité est exploitée pour séparer les LBdes autres cellules.

B. Méthode immunologique par cytométrie couplée à un trieur (FACS)

1. Utilisation d'anticorps couplés à des fluorochromes spécifiques des antigènes cellulaires (ex: anti-lymphocytes T avec fluorochrome rouge, anti-lymphocytes B avec fluorochrome vert).

2. Les cellules passent une à une devant un laser qui les excite.

3. La fluorescence émise est détectée.

4. Les cellules sont redirigées électriquement (cathode/anode) en fonction deleur fluorescence, de leur taille ou de leur granulométrie.

5. Un photomultiplicateur collecte les informations pour l'analyse informatique.

C. Tri magnétique

1. Utilisation d'un anticorps anti-CD19 (spécifique deslymphocytes B) couplé à une bille magnétique.

2. Mélange de l'anticorps avec les cellules; l'anticorps se fixe aux lymphocytes B.

3. Passage de la suspension cellulaire à travers un aimant qui retient les cellules marquées.

4. Libération de l'aimant pour collecter une population pure de lymphocytes B.

V. Principe de cultures de cellules et entretien

1. Cellules en suspension

Étapes de la culture de cellules en suspension:

1. Récupération de l’échantillon: Prélèvement (ex: sang).

2. Mise en culture (passages 0 = P0): Ensemencement dans un milieu favorable, croissance initiale (culture primaire).

3. Confluence: Multiplicaton des cellules jusqu’à saturationdu milieu.

4. Centrifugation: Récupération des cellules dans le culot.

5. Division et diminution de densité (passage 1 = P1): Réduction de la densité cellulaire par division dans de nouvelles boîtes. Il s'agit du repiquage, donnant une culture secondaire.

6. Conservation:

   • Ajout d'agents cryoprotecteurs (glycérol, DMSO) pour éviter l'éclatement cellulaire.

   • Congélation dans de l'azote liquide à -196°Cpour une conservation à long terme.

2. Cellules adhérentes

Les cellules adhérentes prolifèrent jusqu'à confluence. Pour leur entretien:

1. Utilisation de trypsine (enzyme) pour détacher les cellules de leur support.

2. Centrifugation pour récupérer le culot cellulaire.

3. Deux options:

   • Passage/Repiquage: Les cellules sont divisées et ensemencées dans denouvelles boîtes pour permettre une nouvelle prolifération (culture secondaire).

   • Congélation: Stockage similaire aux cellules en suspension.

Note: Certaines cellules adhérentes peuvent perdre leur phénotype d'origine après plusieurspassages.

VI. Dénombrement et qualité des cellules

1. Dénombrement des cellules

Le dénombrement cellulaire est crucial pour standardiser les expériences et évaluer la croissance.

Comment procède-t-on pour ce dénombrement ?

1. Décollement des cellules à la trypsine.

2. Centrifugation.

3. Récupération du culot.

4. Dépôt sur une lame de comptage (cellule de Malassez) avec des quadrillages microscopiques.

5. Comptage manuel des cellules au microscope.

Des méthodes automatiques existent également, utilisant des faisceaux pour compter les cellules.

2. Test de viabilité

Ces tests déterminent la proportion de cellules vivantes et mortes dans une population.

• But du test: Évaluer la santé cellulaire ou la fertilité (ex: spermatozoïdes).

• Nom et principe du test: Test d’exclusion de colorant.

  • Les colorants comme le Bleu Trypan, l'éosine ou l'iodure de propidium pénètrent les cellules dont la membrane est endommagée (cellules mortes).

  • Les cellules vivantes ont une membrane intacte et sont capables d'expulserle colorant, restant non colorées.

  • L'iodure de propidium se fixe à l'ADN des cellules mortes et émet une fluorescence rouge.

VII. Types de cultures cellulaires

1. Cultures primaires et secondaires

Les cultures primaires dérivent directement de prélèvements de tissus (liquides ou solides).

1. Isolation des cellules d'un organe (ex: foie).

2. Mise en culture où elles prolifèrent jusqu'à confluence (tapis homogène).

3. Repiquage des cellules (décollement et remise en culture à moindre densité) pour obtenir des cultures secondaires.

Les cellules en culture primaire ont une durée de vie limitée in vitro et entrent en sénescence aprèsun nombre restreint de passages.

2. Lignées cellulaires

Une lignée cellulaire est une population homogène et stable de cellules ayant une capacité de division illimitée in vitro grâce à des repiquages successifs.

Origine des lignées cellulaires:

• Cellules cancéreuses: Prélevées de tumeurs, elles sont spontanément immortelles. Elles présentent souvent une forte activité de la télomérase, une enzyme protégeant les télomères qui permet une divisionillimitée.

• Cellules saines d’un organe rendues immortelles: Des cellules saines peuvent être transformées par des traitements mutagènes (chimiques, physiques, virus oncogènes comme le T de SV40) pour perturber leur cycle cellulaire. Ces cellules transformées ne sont plus identiques aux cellules d'origine.

Avantage: Durée de vie quasi illimitée, moins de dégénérescence. Inconvénient: Comportement altéré par rapport aux cellules normales, nécessitant une interprétation prudente desrésultats.

3. Cinétique de croissance cellulaire

Différentes phases de la croissance des cellules:

1. Phase de quiescence/latence: Peu ou pas de prolifération initiale.

2. Phase exponentielle: Prolifération intense.

3. Phase stationnaire:

   • Pour les cultures primaires, les cellules arrêtent de se diviser et entrent en sénescence.

   • Pour les lignées cellulaires (transformées/immortalisées), la prolifération reprend après un plateau initial.

Le comportement cellulaire est donc très différent entre une culture primaire et une lignée.

VIII. Conditions de culture

Les conditions du milieu nécessaires à une bonne culture cellulaire:

• Conditions générales:

  • Milieu liquide, atmosphère contrôlée.

  • Culture dans une étuve humide à 37°C.

  • Pression partielle de CO₂ à 5% (essentiel pour le pH).

• Humidité: Maintenue à 83-84% pour prévenir l'évaporation et l'augmentation de l'osmolarité.

• pH: Maintenu à environ 7,4 grâce à des solutions tampons (HEPES, bicarbonate). Le CO₂ sedissocie en H₂CO₃, acidifiant le milieu, que les tampons régulent.

• Taux d’oxygène: Contrôlé; des chambres à hypoxie sont utilisées pour étudier les effets de l'hypoxie.

• Nutrition:

  • Source de carbone (glucose).

  • Source d’azote (acides aminés).

  • Facteurs de croissance (sérum de veau, vitamines, insuline, FGF...).

• Stérilité: Cruciale, car les milieux nutritifs favorisent la croissance bactérienne et fongique.

  • Manipulation sous hotte à flux laminaire.

  • Utilisation de milieux et instruments stériles.

  • Ajout d'antibiotiques (pénicilline, streptomycine) et antifungiques.

IX. Co-cultures

Les co-cultures permettent de cultiver différents types de cellules ensemble pour mieux mimer l'environnement tissulaire originel.

1. Co-culture directe

Deux types de cellules sont cultivés dans la même boîte. L'inconvénient est la difficulté de distinguer les contributions spécifiques de chaque type cellulaire aux sécrétions et aux devenirs.

2. Co-culture indirecte

Les cellules sont physiquement séparées mais peuvent interagir par des facteurssolubles.

Les différents types de co-cultures indirectes:

• Milieux conditionnés:

  • Un type cellulaire (ex: macrophages) produit des molécules (ex: cytokines pro-inflammatoires) dans son milieu de culture.

  • Ce "secrétome" est transféré à une autre culture cellulaire (ex: cellules musculaires lisses vasculaires) pour étudier ses effets.

• Système d’insert:

  • Un type cellulaire est cultivé au fond d'un puits, et un autre est cultivé sur une membrane poreuse dans un insert placé au-dessus.

  • Les molécules secrétées par les cellules de l'insert diffusent à travers la membrane et interagissent avec les cellules du fond du puits. La taille des pores est ajustable.

• Co-culture indirecte par interaction continue:

  • Les deux types cellulaires sont dans des puits séparés mais connectés par un système permettant un échange continu des milieux, sans contact direct des cellules.

X. Les supports deculture : culture 2D/3D

• Culture 2D (monocouche): La plus simple et courante, où les cellules forment une couche plane sur un support (schéma A).

• Culture 3D: Utilisation de gels ou matrices (ex: collagène, hydrogel) pour permettre aux cellules d'interagir dans toutes les dimensions. Les cellules cultivées en 3D sont appelées sphéroïdes (schéma B).

• Il est possible de recréer des environnements 3D même pour des cellules en suspension (schéma D).

Les cellules en 3D ont souvent un aspect et un comportement différents des cellules en 2D, se rapprochant davantage de la physiologie in vivo.

XI. Contraintes mécaniques exercées sur les cellules

Les contraintesmécaniques influencent fortement le comportement cellulaire. Les cellules s'adaptent à leur environnement mécanique.

• Exemple des cellules endothéliales: Dans les vaisseaux sanguins, elles sont soumises à un flux constant. Elles s'alignent selon le sens du flux, devenant moins perméables et moins inflammatoires, réduisant le stress oxydant.

• Contraintes de tension/compression: En culture de chondrocytes (cellules du cartilage), l'application de forces mimant le poids corporel est importante pour leur fonction.

Des bioréacteurs sont utilisés pour recréer ces contraintes environnementales. C'est un domaine clé en ingénierie tissulaire et médecine régénérative.

XII. CULTURE APPLIQUEE A L’INGENIERIE TISSULAIRE

L'ingénierie tissulaire vise à développer des substituts biologiques pour restaurer, maintenir ou améliorer la fonction des tissus. Des cellules prélevées sont cultivées et mises en expansion dans des matrices adéquates avant d'être réimplantées chez l'hôte (ex: reconstructionde peau).

XIII. Organoïdes

Les organoïdes sont des structures 3D formées à partir de cellules souches ou de cellules adultes, reproduisant de manière simplifiée l'architecture et la fonction d'un organe.

• Applications: Étude des mécanismes de maladies, toxicologie, développement embryonnaire, médecine régénérative, dépistage de médicaments.

Explication du processus (ex: organoïde pulmonaire):

1. Isolation de cellules épithéliales pulmonaires (ex: alvéoles).

2. Mise en culture dans une matrice avec des stimulus spécifiques pour la différenciation.

3. Utilisation de facteurs de croissance et de différenciation pour induire la dédifférenciation et la redifférenciation des cellules.

4. Formation d'un amas cellulaire, suivi d'une apoptose au centre pour recréer une structure alvéolaire polarisée.

Des tumoroïdes peuvent également être créés pour étudier les cellules cancéreuses, leur invasion et leur migration.

XIV. Types d’analyses des cellules en culture

Diverses analyses peuvent être effectuées sur les cellules en culture pour la recherche ou le diagnostic.

• Cellules lysées (broyées):

  • Techniques biochimiques et debiologie moléculaire:

    • Fractionnement des organites (ex: noyaux, mitochondries).

    • Western blot (analyse de protéines).

    • RT-PCRq (analyse d'ARN).

• Cellules vivantes:

  • Imagerie, tests fonctionnels: Prolifération, migration, métabolisme (avec sondes spécifiques).

  • Tests enzymatiques: Mesure de l'activité enzymatique (ex: ATPase dans les cellules musculaires).

  • Tri: Pour remettre en culture ou pour analyse ultérieure.

  • Marquage: Sur cellules fixées ou libres (sujet d'un autre cours).

1. Le fractionnement des cellules

Lefractionnement cellulaire permet d'isoler des organites (noyaux, lysosomes, mitochondries) à partir de cellules.

1. Homogénéisation: Broyage du tissu ou des cellules en milieu isotonique.

   • Mécanique: Mortier et pilon.

   • Physique: Ultrasons, fortes pressions.

   • Chimique: Agents détergents, enzymes.

2. Purification:

   • Centrifugation différentielle: Centrifugations successives à vitesses et durées croissantes.

     • Les éléments plus lourds (noyaux) sédimentent en premier à faible vitesse.

     • Les éléments plus légers (mitochondries, lysosomes) sédimentent à vitessesplus élevées.

     • Les microsomes et débris de membrane requièrent une ultracentrifugation (ex: 3h à 100 000g).

   • La purification peut être couplée à la chromatographie oul'électrophorèse pour des molécules.

   • Centrifugation sur gradient de densité: Le broyat est déposé sur un gradient (saccharose, Percoll, Ficoll, glycérol) où les éléments se séparent selon leur densité à l'équilibre. Lesproduits sont ensuite récupérés par élution.

2. Cellules fixées

La fixation tue la cellule en préservant ses structures, permettant des marquages pour l'analyse:

• Coloration.

• Immunocytochimie/fluorescence.

• Hybridation in situ.

• Cytométrie.

3. Purification et analyses biochimiques des organites/protéines cellulaires

Aprèsbroyage des cellules, la centrifugation différentielle est utilisée.

• Centrifugations multiples à différentes vitesses et durées pour séparer les composants:

  • Faible vitesse: Gros éléments comme les noyaux.

  • Vitesse intermédiaire (ex: 15 000g): Mitochondries et lysosomes.

  • Haute vitesse (ultracentrifugation, ex: 100 000g): Nucléoles, microsomes, débris de membrane, Golgi.

• La centrifugation sur gradient de densité (saccharose, percoll, ficoll, glycérol) permet une séparation plus fine basée sur la densité des organites, qui s'arrêtent à leur point d'équilibre. L'élution avec des tampons permet de collecter les fractions séparées.