Biologie Moléculaire : Bases et Techniques

Biologie Moléculaire : La Cheatsheet Essentielle

La biologie moléculaire est l'étude des acides nucléiques (ADN et ARN) et de leur rôle fondamental dans les mécanismes cellulaires. Elle explore la structure, la fonction et la régulation de ces molécules, ainsi que les techniques pour les manipuler et les analyser.

I. Les Acides Nucléiques : ADN et ARN

Les acides nucléiques sont des polymères composés de monomères appelés nucléotides.

A. Composition Chimique

• Les nucléotides sont formés de trois composants :

  1. Un pentose (ose à 5 carbones) :

     • Ribose pour l'ARN

     • Désoxyribose pour l'ADN (le désoxyribose assure une plus grande stabilité à l'ADN, propice à la conservation de l'information génétique).

  2. Une base azotée (purine ou pyrimidine) :

     • Purines (double cycle) : Adénine (A) et Guanine (G). L'Adénine est la seule base sans atome d'oxygène.

     • Pyrimidines (cycle simple) : Cytosine (C), Uracile (U) (dans l'ARN), Thymine (T) (dans l'ADN). Le carbone 5 de la Thymine porte un méthyl.

  3. Un acide phosphorique ().

• Un nucléoside = Base + Sucre (liaison N-osidique). Ex: adénosine, guanosine, cytidine, uridine, désoxyadénosine, désoxythymidine.

• Un nucléotide = Nucléoside + Phosphate (liaison ester sur le carbone 5' du sucre). Ex: AMP, GMP, CMP, UMP (pour ARN) ou dAMP, dGMP, dCMP, dTMP (pour ADN).

• Les nucléotides sont liés entre eux par des liaisons phosphodiester pour former les chaînes d'acides nucléiques. Ces liaisons sont établies entre le 5' phosphate d'un nucléotide et le 3' hydroxyle du suivant.

• Les liaisons entre les acides phosphoriques dans les nucléotides triphosphates (ex: ATP, GTP, CTP, UTP et leurs versions désoxy) sont des liaisons riches en énergie ().

• Les enzymes utilisant un nucléoside triphosphate comme substrat nécessitent le cation Mg++ comme cofacteur.

B. Structure de l'ADN

• L'ADN est une double hélice constituée de deux chaînes de nucléotides antiparallèles et complémentaires.

• Les bases azotées sont tournées vers l'intérieur et s'apparient selon les règles de Watson-Crick par des liaisons hydrogène :

  • Adénine (A) avec Thymine (T) (2 liaisons H).

  • Guanine (G) avec Cytosine (C) (3 liaisons H).

• La règle de Chargaff (observée en 1940) stipule que quelque soit l'origine de l'ADN, [A] = [T] et [G] = [C], donc [Purines] = [Pyrimidines].

• Le squelette sucre-phosphate, hydrophile, est tourné vers l'extérieur.

• La double hélice peut être droite (rotation anti-horaire, la plus courante, forme B) ou gauche (rotation horaire).

• La taille des acides nucléiques est exprimée en longueur, masse moléculaire en Dalton (Da), ou en nombre de nucléotides (b) pour simple brin et paires de bases (pb) pour double brin.

C. Types d'ARN

• L'ARN est généralement simple brin. Il est synthétisé de 5' en 3', en copiant le brin antisens de l'ADN, avec remplacement des T par des U.

• ARNr (ARN ribosomal) : participe à la structure des ribosomes (80% des ARN totaux).

• ARNt (ARN de transfert) : transporteur des acides aminés activés pour la traduction (15%). Possède un anticodon complémentaire du codon de l'ARNm et un site de fixation de l'acide aminé correspondant.

• ARNm (ARN messager) : porte l'information génétique à traduire (5%).

• ARN fonctionnels (ARNf) :

  • snRNA : petits ARN nucléaires (100-200 bases), maturation des ARNm (épissage) et ARNr.

  • snoRNA : petits ARN nucléolaires (≈100 bases), maturation des ARNr.

  • siRNA (small interfering RNA) et miRNA (micro ARN) : petits ARN (≈20 bases) impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle et l'interférence ARN.

• Certains ARN, appelés ribozymes, ont des propriétés catalytiques (ex: l'ARNr catalyse la formation de la liaison peptidique dans le ribosome).

II. Le Dogme Central de la Biologie Moléculaire

Le flux d'information génétique est généralement : ADN ARN Protéines.

A. Réplication de l'ADN

• Définition : Processus de copie de l'ADN pour obtenir deux molécules d'ADN identiques à partir d'une seule.

• Semi-conservative : Chaque nouveau brin d'ADN est composé d'un brin parental et d'un brin nouvellement synthétisé (démontré par Meselson et Stahl en 1957).

• Direction de synthèse : Toujours de 5' vers 3'. L'ADN polymérase ajoute des nucléotides uniquement à l'extrémité 3'-OH libre.

• Asymétrie de la réplication :

  • Brin précoce (brin continu) : Synthétisé en continu dans le sens 5'->3'.

  • Brin retardé (brin discontinu) : Synthétisé par fragments (fragments d'Okazaki de 1000 à 2000 pb) qui sont ensuite liés.

• Mécanisme (chez les eucaryotes) :

  • Origine de réplication : L'ADN est répliqué à partir de multiples points d'origine. Un réplicon est une zone d'ADN répliquée à partir d'une même origine.

  • Hélicase : Ouvre la double hélice.

  • Primase (ARN polymérase) : Synthétise de courtes amorces d'ARN car l'ADN polymérase ne peut pas initier la synthèse.

  • ADN polymérases (plusieurs types chez les eucaryotes) :

    • Pol α : Synthèse de l'amorce, élongation et réparation de l'ADN.

    • Pol δ : Élongation des brins et réparation de l'ADN. Activée par PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen).

    • Pol ε : Réparation et remplacement de l'ARN sur le brin retardé.

    • Pol β : Réparation de l'ADN.

    • Pol γ : Réplication de l'ADN mitochondrial.

  • Protéines accessoires des ADN polymérases :

    • PCNA : Activateur puissant de Pol δ.

    • RF-A (Replication factor A) : Se fixe sur l'ADN simple brin, indispensable à Pol α et δ.

    • RF-C (Replication factor C) : Se fixe sur l'ADN au niveau des amorces, activité ATPasique.

  • RNase H : Détruit les amorces d'ARN.

  • Ligase 1 : जॉइंट les fragments d'Okazaki.

B. Transcription

• Définition : Synthèse d'une molécule d'ARN à partir d'une matrice ADN.

• Trois étapes : Initiation, Élongation, Terminaison.

• L'ARN polymérase lit le brin antisens (brin -) de l'ADN dans le sens 3' 5' pour synthétiser un ARN qui sera identique au brin sens (brin +), avec U à la place de T.

• Chez les eucaryotes :

  • Génome discontinu : Les gènes contiennent des séquences codantes (exons) et non codantes (introns).

  • Promoteur : Région en amont du site d'initiation (5') régulant la transcription, site de fixation de l'ARN polymérase et des facteurs de transcription (ex: TATA box à -25 nucléotides).

  • Enhancers (activateurs) et silencers (répresseurs) : Séquences régulatrices parfois éloignées.

  • ARN polymérases eucaryotes :

    • Pol I : Transcrit les ARNr (18S, 5.8S, 28S).

    • Pol II : Transcrit les ARNm et certains snRNA.

    • Pol III : Transcrit les ARNt et ARNr 5S.

    • Pol IV : Transcription de l'ADN mitochondrial et hétérochromatine (chez les plantes).

  • Modifications post-transcriptionnelles :

    • Épissage : Élimination des introns et liaison des exons, réalisé par le spliceosome (snRNP).

    • Ajout d'une coiffe 5' et d'une queue poly-A 3'.

• Inhibiteurs spécifiques de la transcription :

  • Rifamycines (Rifampicine) : Inhibent l'ARN polymérase (fixation sur sous-unité β).

  • Actinomycines : Inhibent l'élongation en se fixant sur les paires GC de l'ADN.

C. Traduction

• Définition : Synthèse de protéines à partir d'un ARNm.

• Code génétique : Universel (avec rares exceptions, ex: mitochondries, certains protistes), dégénéré (un acide aminé peut être codé par plusieurs codons).

• Synthèse polarisée : De l'extrémité NH2-terminale vers l'extrémité COOH-terminale de la protéine.

• Lieu : Les ribosomes.

• L'ARNt, chargé par une aminoacyl-tRNA-synthétase spécifique, a une extrémité 3' sur laquelle se fixe l'acide aminé et un anticodon à l'autre extrémité qui s'apparie avec le codon de l'ARNm.

• Chez les eucaryotes, la coiffe 5' de l'ARNm sert de point de repère pour l'initiation.

III. Les Outils et Techniques de la Biologie Moléculaire

A. Culture Cellulaire

• Définition : Croissance de cellules hors de leur organisme d'origine (ex-vivo).

• Applications : recherche fondamentale, toxicologie, caryotype fœtal, production de peau, culture de virus.

• Types de cellules :

  • Lignées primaires : proches des cellules in vivo, mais cultivables difficilement (apoptose).

  • Cellules "immortalisées" : durée de vie augmentée (ex: lymphocytes B par EBV, fibroblastes par SV40).

  • Cellules tumorales : transformées artificiellement ou prélevées chez un patient (ex: HeLa).

• Méthodes : Culture primaire (à partir d'un fragment de tissu ou de cellules dissociées enzymatiquement, ex: trypsine), culture secondaire (repiquage).

• Conditions nécessaires : Stérilité (hotte), incubateurs (contrôle et température), milieux de culture adéquats.

B. Purification des Acides Nucléiques

• Matrices : Sang total, plasma, sérum, tissu.

• Étapes générales :

  1. Lyse des membranes (détergent).

  2. Centrifugation (séparer lipides des acides nucléiques).

  3. Isolation (silice ou mini-colonne).

  4. Dégradation/élimination des protéines (protéinase K, tampons de lavage).

  5. Précipitation des acides nucléiques à l'éthanol.

  6. Élution dans l'eau distillée ou tampon.

C. Électrophorèse sur Gel

• Définition : Méthode de séparation de molécules chargées (ADN, ARN, protéines) en fonction de leur taille par migration dans un champ électrique à travers une matrice.

• Matrices : Gel d'agarose (pour ADN, ARN, moins toxique que l'acrylamide), gel de polyacrylamide.

• Principe : Les acides nucléiques, chargés négativement en milieu basique (pH 8), migrent vers l'anode. Les petites molécules migrent plus vite et plus loin.

• Visualisation :

  • Marquage fluorescent : Bromure d'éthidium (BET) (toxique, mutagène), SYBR Green I ou II, GelRed, GelGreen. Ceux-ci s'intercalent dans l'ADN double brin et fluorescent sous UV.

  • Bleu de Coomassie pour les protéines.

• Détermination de taille : Utilisation d'une échelle de marqueur de taille (DNA ladder).

• Gamme de tailles idéales (kb) pour agarose : 0.3% (5-60), 0.9% (0.5-7), 1.2% (0.4-6), 2.0% (0.1-2).

• Techniques associées :

  • Southern Blot : Récupération d'ADN après électrophorèse pour hybridation.

  • Western Blot : Pour les protéines.

D. PCR (Polymerase Chain Reaction)

• Définition : Amplification in vitro d'un fragment d'ADN cible pour en obtenir une quantité suffisante. (prix Nobel de chimie en 1993, Kary Mullis).

• Applications : Identification d'espèces/individus, santé, criminalistique, archéologie.

• Composition du mix réactionnel :

  • Matrice d'ADN.

  • dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) : Substrats.

  • ADN polymérase thermostable : Taq polymérase (de _Thermus aquaticus_). Optimalement active à 70-75°C, activitée exonucléase 5'-3'.

  • Couple d'amorces (oligonucléotides spécifiques) : Délimitent la région à amplifier, fournissent une extrémité 3'-OH libre. Nécessitent de connaître les séquences aux extrémités de la cible. Les amorces ne doivent pas être complémentaires entre elles ou se replier.

  • Tampon : Contenant MgCl2 (cofacteur enzymatique).

  • Thermocycleur : Appareil contrôlant précisément les températures.

• Cycles : Répétition de 3 étapes, amplification exponentielle ().

  1. Dénaturation (95°C) : Séparation des brins d'ADN.

  2. Hybridation des amorces (60-65°C, dépend du Tm des amorces) : Les amorces se fixent spécifiquement. Le Tm (Melting Temperature) est la température où 50% de l'ADN est simple brin; il dépend du %GC et %AT. .

  3. Élongation (72°C) : L'ADN polymérase synthétise de nouveaux brins.

• Types de PCR :

  • PCR conventionnelle : Qualitative. Détection des produits par électrophorèse (BET).

  • PCR en temps réel (qPCR) : Qualitative et Quantitative. Détecte l'amplicon pendant la réaction (_in situ_). Utilise des molécules fluorescentes (augmentation de sensibilité, spécificité).

    • Ct (cycle seuil) : Cycle où la fluorescence est détectable, proportionnel à la quantité de matrice initiale. Permet d'établir une courbe standard avec des quantités connues.

    • Chimies fluorescentes :

      • Agents intercalants (ex: SYBR Green I) : Se fixent sur tout ADN double brin, non spécifique. Fluorescence émise quand il se fixe sur l'ADN db.

      • Sondes d'hybridation (ex: TaqMan®, Molecular Beacon®) : Spécifiques d'une séquence cible, marquées par fluorophore (reporter) et quencher.

        • TaqMan : Sonde hydrolysée par l'activité 5'-exonucléase de la polymérase, séparant reporter et quencher, émettant de la fluorescence. Permet la PCR multiplex. Taille 20-40 pb, 40-60% GC, Tm de 6-10°C plus élevé que les amorces. Éviter G en 5'.

        • Molecular Beacon : Structure en épingle à cheveux, repliée (pas de fluorescence) ; s'hybride à la cible, séparant reporter et quencher (fluorescence). Restent intactes.

      • Amorces fluorescentes (ex: Scorpions®, LUX™, Plexor®).

  • RT-PCR : Détection de cible ARN. Étape de reverse transcription (ARN en ADNc) puis PCR classique.

  • PCR emboîtée (Nested PCR) : Deux étapes avec deux couples d'amorces différents. Améliore sensibilité et spécificité. Utile pour virus à ARN très mutables.

  • PCR multiplex : Amplifier plusieurs cibles dans un même tube. Nécessite sondes/fluorophores différents en temps réel, amplicons de tailles différentes en conventionnel.

• Prévention de la contamination : Labo divisé en 3 salles (extraction, préparation réactifs, amplification/détection), réactifs non réutilisés, gants, blouse dédiée.

E. Autres Techniques

• Séquençage du génome : Déterminer l'ordre des nucléotides d'un fragment d'ADN (utilisé aussi pour la description de l'anatomie d'un gène/allèle).

• Hybridation in situ (FISH, CGH-array) : Localisation de séquences spécifiques sur des chromosomes ou cellules.

• Micromatrices/Puces : Analyse d'expression de nombreux gènes simultanément.

• Test du double hybride (Yeast two-hybrid) : Tester les interactions protéine-protéine en utilisant l'appât (bait) et la cible (prey).

• Centrifugation par gradient de densité : Séparer des objets biologiques (cellules, organites, etc.) selon leur densité.

IV. Lésions de l'ADN et Réparation

• L'ADN peut subir des lésions d'origine endogène ou exogène (radiation UV, agents mutagènes, etc.).

• Exemples de lésions : dimères de pyrimidines (UV), adduits de substances génotoxiques, cassures double brin (radiations ionisantes).

• Mécanismes de réparation :

  • Réparation par réversion directe (ex: O6-méthylguanine).

  • Réparation des mésappariements (MMR).

  • Réparation par excision de base (BER) (ex: sites abasiques, 8-oxoguanine).

  • Réparation par excision de nucléotide (NER) (ex: dimères de thymine, adduits du cisplatine).

  • Recombinaison homologue (HRR) et Recombinaison non homologue (NHEJ) (ex: cassures double brin).

Biologie Moléculaire : Des Acides Nucléiques aux Techniques d'Étude

I. Les Acides Nucléiques : Structure et Composition

A. Composition Chimique des Nucléotides

1. Un pentose (sucre à 5 carbones) : un ribose (pour l'ARN) ou un désoxyribose (pour l'ADN).
2. Une base azotée : purique (Adénine, Guanine) ou pyrimidique (Cytosine, Uracile, Thymine).
3. Un ou plusieurs groupements phosphate (acide phosphorique H₃PO₄).

1. Le Pentose

• Ribose : Sucre présent dans l'ARN.
• Désoxyribose : Présent dans l'ADN. Il se distingue du ribose par la réduction de la fonction alcool secondaire sur le carbone n°2 (perte d'un atome d'oxygène). Cette modification confère à l'ADN une plus grande stabilité, essentielle pour sa fonction de conservation de l'information génétique.

2. Les Bases Azotées

• Purines : Possèdent un noyau bicyclique.
  • Adénine (A) : Possède un noyau purine dont le carbone 6 est substitué par une fonction amine. C'est la seule base dont la formule ne contient pas d'atome d'oxygène.
  • Guanine (G) : Possède un noyau purine dont le carbone 2 est substitué par une fonction amine et le carbone 6 par une fonction cétone.
• Pyrimidines : Possèdent un noyau monocyclique.
  • Cytosine (C) : Possède une fonction amine sur le carbone 4 et une fonction cétone sur le carbone 2.
  • Uracile (U) : Présent dans l'ARN, il possède des fonctions cétone sur les carbones 2 et 4.
  • Thymine (T) : Présente dans l'ADN en remplacement de l'Uracile. Elle possède des fonctions cétone sur les carbones 2 et 4, et le carbone 5 est substitué par un groupe méthyl.

3. Nucléosides et Nucléotides

• Un nucléoside est formé d'une base azotée liée à un sucre (ribose ou désoxyribose) par une liaison N-osidique.
  • Exemples de ribonucléosides : guanosine, cytidine, uridine.
  • Exemples de désoxyribonucléosides : désoxyadénosine, désoxycytidine, désoxythymidine (souvent appelée thymidine).
• Un nucléotide est un nucléoside lié à un ou plusieurs groupes phosphate. La liaison entre le carbone 5 du sucre et le phosphate est une liaison ester.
• Les nucléosides monophosphates sont désignés comme des nucléotides (ex: AMP, CMP, GMP, UMP pour les ribonucléotides ; dAMP, dCMP, dGMP, dTMP pour les désoxyribonucléotides).
• Les liaisons anhydrides unissant les acides phosphoriques dans les di- ou triphosphates (ex: ATP) sont des liaisons riches en énergie ().

Exemples de Nucléotides Composés :

• Adénosine triphosphate (ATP) : Composé d'adénine, d'un -D-ribose, et de trois phosphates. L'ATP est un substrat pour les ARN polymérases.
• Autres nucléosides triphosphates : GTP, CTP, UTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Le dCTP est, par exemple, un substrat pour les ADN polymérases.

B. Structure des Acides Nucléiques

1. Structure de l'ADN

• Les bases azotées sont tournées vers l'intérieur de la double hélice.
• Les riboses et les acides phosphoriques, hydrophiles, sont tournés vers l'extérieur.

2. Appariement des Bases (Règle de Chargaff)

• L'adénine (A) s'apparie avec la thymine (T) via deux liaisons hydrogène.
• La guanine (G) s'apparie avec la cytosine (C) via trois liaisons hydrogène.
• Ces appariements sont appelés appariements de Watson-Crick.
• La règle de Chargaff (observée en 1940) stipule que, quelle que soit l'origine de l'ADN, le nombre de purines est toujours égal au nombre de pyrimidines ([Pur] = [Pyr]), et en particulier et .

3. Hélice Droite ou Gauche

4. Lésions de l'ADN

• Dimères de pyrimidines (causés par les UV).
• Adduits d'hydrocarbures aromatiques polycycliques (ex: benzopyrène).
• Coupures double brin (par radiations ionisantes ou topoisomérases).

C. Types d'ARN

• ARN ribosomique (rRNA) : Participe à la structure des ribosomes. Il représente environ 80% des ARN totaux.
• ARN de transfert (tRNA) : Transporteur des acides aminés activés pour la traduction. Représente environ 15% des ARN totaux. L'ARNt possède un anticodon (séquence de trois nucléotides) complémentaire et antiparallèle au codon de l'ARNm.
• ARN messager (mRNA) : Produit de la transcription d'un gène, il porte l'information à traduire. Représente environ 5% des ARN totaux.
• snRNA (petits ARN nucléaires) : Rôle dans la maturation des ARNm (épissage) et des ARNr.
• snoRNA (petits ARN nucléolaires) : Rôle dans la maturation des ARNr.
• miRNA (micro ARN) : Petits ARN (~20 bases) intervenant dans la régulation post-transcriptionnelle.
• siRNA (petits ARN interférents) : Petits ARN complémentaires à 100% des ARNm cibles, impliqués dans l'interférence ARN.
• Ribozymes : Certains ARN sont doués de propriétés catalytiques, agissant comme des enzymes. L'ARN ribosomique, par exemple, catalyse la formation de la liaison peptidique au sein du ribosome.

Propriétés des brins d'acides nucléiques :

• Polarité 5' → 3' : Les deux brins de l'ADN sont antiparallèles, leurs polarités 5' → 3' étant inversées.
• La taille des acides nucléiques est exprimée en longueur, en masse moléculaire (Dalton, Da), ou en nombre de nucléotides (b pour simple brin, pb pour paires de bases en double brin).

II. Les Processus Fondamentaux de la Biologie Moléculaire

A. Réplication de l'ADN

1. Mécanisme Général

• Ouverture de la double hélice : Une topoisomérase II (TOP2) détend l'ADN, puis une hélicase ouvre la double hélice. Une protéine RPA (Replication protein A) se fixe sur l'ADN simple brin, essentielle pour l'action des polymérases et .
• Synthèse de l'amorce : L'ADN polymérase ne peut initier la synthèse mais seulement la poursuivre à partir d'une amorce. Une primase (ARN polymérase) synthétise un brin d'ARN d'environ dix nucléotides. Le FRC (Facteur de réplication C) se fixe sur l'ADN au niveau des amorces et possède une activité ATPasique.
• Élongation : Synthétisée en direction 5'→3'.
  • Sur le brin précoce (brin avancé) : La synthèse est continue au fur et à mesure que le duplex parental est déroulé.
  • Sur le brin retardé : La synthèse est discontinue, donnant naissance à des fragments d'Okazaki (1000 à 2000 pb) synthétisés en direction 5'→3'. Ces fragments sont ensuite reliés par une ligase 1 (LIG1).

2. ADN Polymérases Eucaryotes

• Polymérase (POLA) : Synthétise l'amorce, participe à l'élongation et à la réparation de l'ADN.
• Polymérase : Impliquée dans la réparation de l'ADN.
• Polymérase : Responsable de la réplication de l'ADN mitochondrial.
• Polymérase : Impliquée dans l'élongation des brins et la réparation de l'ADN. Elle est fortement activée par PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen).
• Polymérase : Rôle dans la réparation et le remplacement de l'ARN sur le brin retardé. Elle est aussi activée par le PCNA, mais son action n'est pas indispensable.

3. Réplication chez les Eucaryotes vs Procaryotes

• Réplicons : Un seul réplicon chez les procaryotes, plusieurs chez les eucaryotes. Un réplicon est une zone d'ADN répliquée à partir d'une unique origine de réplication.
• L'ADN eucaryote est plus long et possède plusieurs origines de réplication activées de manière synchronisée.

B. Transcription

1. Mécanisme

• L'ARN polymérase lit le brin antisens (brin (-)) de l'ADN en allant dans le sens 3'→5'.
• Elle synthétise un ARN complémentaire de ce brin antisens, donc identique au brin sens (brin (+)), avec le remplacement des T par des U.
• La transcription se déroule en trois étapes : Initiation, Élongation, Terminaison.

2. Particularités chez les Eucaryotes

• Génome diploïde, éclaté ou en mosaïque (introns et exons).
• Expression compartimentée, avec une unité de transcription monocystronique.
• Quatre types d'ARN polymérases :
  • ARN polymérase I : Transcrit les ARNr (18S, 5.8S, 28S).
  • ARN polymérase II : Transcrit les ARNm et certains snRNA.
  • ARN polymérase III : Transcrit les tRNA et ARNr 5S.
  • ARN polymérase IV (chez les plantes) : Spécialisée dans la transcription de l'ADN mitochondrial et la synthèse de l'hétérochromatine.
• Modifications post-transcriptionnelles :
  • Épissage : Élimination des introns (séquences non codantes) et ligation des exons (séquences codantes). Réalisé par le spliceosome (complexe de snRNP, ex: U1, U2, U4, U5, U6). La coiffe en 5' de l'ARNm sert de point de repère.
  • Les gènes eucaryotes ont également des régions régulatrices comme le promoteur (site de fixation de l'ARN polymérase), souvent avec une TATA box à -25 nucléotides du site d'initiation (inconstante). Des enhancers ou silencers peuvent aussi réguler la transcription.

3. Inhibiteurs Spécifiques de la Transcription

• Rifamycines (Rifampicine, rifabutine) : Inhibent l'ARN polymérase en se fixant sur la sous-unité .
• Streptomycines : Inhibent l'ARN polymérase en se fixant sur une autre sous-unité .
• Actinomycines : Inhibent l'élongation en se fixant sur les paires de bases GC de l'ADN.

C. Traduction

1. Code Génétique

• Le code est dégénéré : 61 codons codent pour les 20 acides aminés, ce qui signifie qu'un acide aminé peut être codé par plusieurs codons (souvent différents par le 3ème nucléotide).
• Le code est universel : Le même pour tous les êtres vivants, à quelques rares exceptions près (certains protistes, les mitochondries).
• Le polypeptide est synthétisé sur les ribosomes, de l'extrémité NH₂ terminale vers l'extrémité COOH terminale.

III. Techniques de Biologie Moléculaire

A. Culture Cellulaire

• Lignées primaires : Caractéristiques des "vraies cellules", mais difficiles à cultiver (apoptose).
• Cellules "immortalisées" : Durée de vie augmentée par infection virale (ex: lymphocytes B par EBV, fibroblastes par SV40).
• Cellules tumorales : Artificiellement transformées par un oncogène ou prélevées chez un patient (ex: HeLa).

1. Principe de la Culture

• Utilisation d'un fragment de tissu : Les cellules se développent à la surface d'un support.
• Fragmentation de l'organe : Dissociation mécanique et enzymatique (protéases comme la trypsine) pour obtenir une suspension cellulaire.
• Culture primaire : Première mise en culture.
• Culture secondaire : Cellules repiquées après dissociation.

2. Conditions de Culture

• Stérilité (hotte stérile).
• Flacons de culture, étuves aérobies (contrôle et température).
• Milieux de culture adéquats.

3. Applications de la Culture Cellulaire

• Recherche fondamentale.
• Études de toxicologie dans l'industrie.
• Études chromosomiques (caryotypes fœtaux).
• Production de peau neuve pour autogreffe.
• Culture de virus (production de vaccins, diagnostic).

B. Extraction et Purification des Acides Nucléiques

1. Prélèvement de l'échantillon (plasma, sérum, sang total, tissu).
2. Lyse des membranes (cytoplasmique et nucléaire) avec un détergent.
3. Centrifugation pour séparer les lipides des acides nucléiques.
4. Isolation de l'ARN/ADN avec de la silice ou une mini-colonne.
5. Tampons de lavage et/ou enzyme protéinase K pour dégrader et éliminer les protéines.
6. Précipitation des acides nucléiques avec l'éthanol.
7. Élution dans de l'eau distillée ou un tampon d'élution.

C. Électrophorèse sur Gel

• Les acides nucléiques, chargés négativement en milieu basique (pH 8), migrent vers l'anode.
• Les petites molécules migrent plus rapidement et plus loin.
• Supports : gels d'agarose (pour ADN/ARN) ou d'acrylamide (pour protéines/petits acides nucléiques).

1. Gels d'Agarose

• L'agarose est un polymère à base d'agar purifié.
• La concentration d'agarose détermine la gamme de tailles d'ADN séparables (ex: 0.9% pour 0.5-7 kb, 1.2% pour 0.4-6 kb).
• Visualisation : Coloration avec des agents intercalants fluorescents (ex: bromure d'éthidium (BET), SYBR Green I, GelGreen, GelRed). Le SYBR Green I se fixe spécifiquement à l'ADN double brin, et le SYBR Green à l'ADN simple brin.
• Un marqueur de taille (DNA ladder) est utilisé pour estimer la taille des fragments.
• Techniques associées :
  • Southern blot : Pour détecter l'ADN après électrophorèse.
  • Western blot : Pour les protéines.

D. PCR (Polymerase Chain Reaction)

1. Historique

• 1986 : Première publication par Kary Mullis (Prix Nobel de Chimie 1993).
• 1988 : Première PCR avec ADN polymérase thermostable (Taq polymérase).
• 1991 : Première détection par sonde.
• 1992 : Invention de la PCR en temps réel par Higuchi R.

2. Composants Nécessaires à la PCR

• Matrice d'ADN : L'ADN à amplifier.
• Déssoxyribonucléotides triphosphates (dNTPs) : dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
• ADN polymérase thermostable : Ex: Taq polymérase (de Thermus aquaticus), Pfu polymérase, Vent polymérase. Cette enzyme est résistante à des températures très élevées (optimale 70-75°C) et possède une activité exonucléase 5'→3' mais n'a pas d'activité exonucléasique 3'→5' (correction des erreurs).
• Tampon de la Taq ADN polymérase, incluant (cofacteur enzymatique).
• Couple d'oligonucléotides spécifiques (amorces) : Encadrent la région cible.
  • Double rôle : S'hybrident à la matrice et servent d'amorce (extrémité 3'-OH libre) pour l'ADN polymérase.
  • Nécessitent la connaissance des séquences nucléotidiques des extrémités de la région à amplifier.
  • Ne doivent pas être complémentaires entre elles ni contenir de séquences répétées inversées (pour éviter les repliements intramoléculaires).
• Thermocycleur : Appareil contrôlant précisément la température de manière cyclique.

3. Étapes d'un Cycle PCR

1. Dénaturation (95°C) : Séparation des deux brins d'ADN (rupture des liaisons hydrogène).
2. Hybridation des amorces (60-65°C) : Les amorces se fixent spécifiquement aux séquences complémentaires sur les brins dénaturés. La Température de fusion (Tm) des amorces dépend de leur composition en GC (Tm = [2 x (A+T) + 4 x (G+C)]).
3. Élongation (72°C) : La Taq polymérase synthétise de nouveaux brins d'ADN à partir des amorces.

4. Types de PCR

• PCR Conventionnelle :
  • Qualitative seulement.
  • Détection des produits par électrophorèse sur gel d'agarose avec coloration au bromure d'éthidium.
• PCR en Temps Réel (qPCR ou Real-Time PCR) :
  • Qualitative et quantitative.
  • Détecte les amplicons pendant la réaction via l'émission de fluorescence.
  • La fluorescence est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons.
  • Le Ct (cycle seuil) est le cycle où la fluorescence est détectable, il est inversement proportionnel à la quantité de matrice initiale.
  • Diminue le risque de contamination post-PCR (pas d'ouverture de tube).
  • Utilise diverses chimies de détection :
    • Agents intercalants : Ex: SYBR®green I (non spécifique, se fixe sur tout ADN double brin). La fluorescence est émise lorsque le SYBR Green se fixe à l'ADN double brin formé pendant l'élongation.
    • Sondes d'hybridation (spécifiques) :
      • Sondes TaqMan® : Basées sur la technologie FRET. Une sonde est marquée par un fluorochrome émetteur (reporter) à 5' et un fluorochrome suppresseur (quencher) à 3'. Lorsque la sonde est intacte, le quencher inhibe le reporter. Durant l'élongation, si la sonde s'hybride à la cible, l'activité 5'-exonucléase de la polymérase hydrolyse la sonde, séparant le reporter du quencher et permettant l'émission de fluorescence. Caractéristiques de la sonde TaqMan : 20-40 pb, 40-60% GC, Tm 6-10°C plus élevé que les amorces, éviter G en 5' (suppression de fluorescence). La PCR multiplex est possible avec TaqMan en utilisant différents fluorophores.
      • Sondes Molecular Beacon® : Possèdent une structure en épingle à cheveux avec un reporter et un quencher. À l'état libre, la fluorescence est éteinte. Lors de l'hybridation à la cible, la structure s'ouvre, séparant le reporter du quencher et activant la fluorescence. Elles restent stables pendant la réaction et peuvent se ré-hybrider.
    • Amorces fluorescentes : Ex: Scorpion®, LUX™, Plexor®.
• RT-PCR (Reverse Transcription PCR) :
  • Utilisée pour la détection de cibles ARN.
  • Première étape : Transcription inverse (par une transcriptase inverse) pour convertir l'ARN en ADNc.
  • Suit les étapes classiques de la PCR (conventionnelle ou en temps réel).
• PCR Multiplex :
  • Amplification de plusieurs cibles dans un même tube.
  • En temps réel : Nécessite des sondes et fluorophores différents pour chaque cible.
  • En conventionnel : Nécessite que les amplicons aient des tailles différentes pour être distingués sur gel.
  • Attention à la spécificité des amorces/sondes et à leur fonctionnement à la même température.
• PCR Emboîtée (Nested PCR) :
  • PCR en deux étapes successives avec deux couples d'amorces.
  • Le premier couple amplifie une région plus large, le second couple (interne) amplifie une séquence située à l'intérieur du premier amplicon.
  • Augmente la sensibilité et la spécificité, utile pour des virus à haute mutabilité.

5. Hygiène du Laboratoire PCR

1. Salle d'extraction.
2. Salle de préparation des réactifs (réactifs ne doivent pas être réutilisés et les contaminés jetés).
3. Salle d'amplification/détection.

E. Autres Méthodes d'Études des Gènes

• Séquençage du génome : Détermination de l'ordre d'enchaînement des nucléotides.
• Hybridation in situ :
  • FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) : Utilise des sondes fluorescentes pour détecter des séquences spécifiques sur les chromosomes.
  • CGH-array (Hybridation Génomique Comparative) : Permet de détecter des variations du nombre de copies d'ADN.
• Micromatrices / Puces à ADN : Testent une banque de molécules (ADN, protéines) sur des plaques microtitres. Chaque puits peut tester une protéine codée par un ADN spécifique.
• Marquage au bleu de Coomassie : Technique de coloration des protéines (souvent après électrophorèse).
• Centrifugation par gradient de densité : Permet de séparer des objets biologiques (cellules, organites, acides nucléiques) selon leur densité.

Conclusion

Introduction à la Biologie Moléculaire

La biologie moléculaire est une discipline qui étudie les processus biologiques au niveau moléculaire, en se concentrant principalement sur les interactions entre les macromolécules biologiques telles que les acides nucléiques (ADN et ARN), les protéines et les lipides. Elle cherche à comprendre comment ces molécules collaborent pour permettre le fonctionnement des cellules et des organismes.

Quatre classes de Macromolécules

La vie est basée sur quatre grandes classes de macromolécules, qui sont des polymères essentiels :

• Glucides (sucres) : Source d'énergie et composants structuraux.

• Lipides (graisses) : Composants des membranes cellulaires, stockage d'énergie et signalisation.

• Protéines : Catalyseurs (enzymes), transporteurs, éléments structuraux, régulateurs, etc.

• Acides nucléiques : Porteurs de l'information génétique.

Le "Dogme Central" de la Biologie Moléculaire Actuel

Le dogme central décrit le flux d'information génétique au sein d'un système biologique. Initialement formulé par Francis Crick, il a évolué avec la découverte de nouveaux mécanismes :

• De l'ADN à l'ARN : Processus de Transcription.

• De l'ARN aux Protéines : Processus de Traduction.

• De l'ARN à l'ADN : Processus de Transcription inverse (rétrotranscription).

D'autres mécanismes importants complètent ce dogme :

• Réplication de l'ADN : Copie de l'ADN.

• Épigénèse : Modifications de l'expression des gènes sans altérer la séquence d'ADN.

• Épissage : Maturation des ARN en supprimant les introns.

• Édition : Modification de la séquence nucléotidique des ARN.

• Régulation de l'expression génique.

• Évolution et formation de gènes.

1. Rappels sur le Génome : Les Acides Nucléiques

Les acides nucléiques, ADN et ARN, sont les molécules responsables du stockage et de la transmission de l'information génétique.

1.1 Composition Chimique Simple

Les acides nucléiques sont des polymères de nucléotides, eux-mêmes composés de trois éléments :

1. Un ose à 5 carbones (pentose) : Ribose (dans l'ARN) ou Désoxyribose (dans l'ADN).

2. Une base azotée : Purine ou Pyrimidine.

3. Un groupe acide phosphorique ().

A) Ribose et Désoxyribose

• Le désoxyribose se distingue du ribose par la réduction de la fonction alcool secondaire au niveau du carbone n°2. Cette différence confère à l'ADN une plus grande stabilité, essentielle pour sa fonction de conservation de l'information génétique.

B) Bases Azotées

Elles sont classées en deux catégories :

• Purines (double cycle) :

  • Adénine (A) : Noyau purine avec une fonction amine sur le carbone 6. C'est la seule base sans atome d'oxygène.

  • Guanine (G) : Noyau purine avec une fonction amine sur le carbone 2 et une fonction cétone sur le carbone 6.

• Pyrimidines (simple cycle) :

  • Cytosine (C) : Carbone 4 avec fonction amine, carbone 2 avec fonction cétone.

  • Uracile (U) : Carbone 2 et 4 avec fonctions cétone (présent uniquement dans l'ARN).

  • Thymine (T) : Carbone 2 et 4 avec fonctions cétone, et un groupement méthyl sur le carbone 5 (présent uniquement dans l'ADN).

C) L'Acide Phosphorique

Un groupe phosphate se lie au sucre. Il confère une charge négative aux acides nucléiques.

D) Nucléosides et Nucléotides

• Un nucléoside est formé d'une base azotée liée à un sucre (ribose ou désoxyribose) par une liaison N-osidique.

  • Exemples de désoxyribonucléosides : désoxyadénosine, désoxycytidine, désoxythymidine (thymidine).

  • Exemples de ribonucléosides : guanosine, cytidine, uridine.

• Un nucléotide est un nucléoside lié à un ou plusieurs groupes phosphate, via une liaison ester au carbone 5' du sucre. Les liaisons anhydrides entre les groupes phosphoriques (dans les di- ou triphosphates) sont des liaisons riches en énergie ().

Nomenclature des unités nucléotidiques :

• Pour les acides ribonucléiques (ARN) : AMP (adénosine monophosphate), CMP (cytidine monophosphate), GMP (guanosine monophosphate), UMP (uridine monophosphate).

• Pour les acides désoxyribonucléiques (ADN) : dAMP, dCMP, dGMP, dTMP.

Les nucléotides triphosphates sont des substrats essentiels pour les ADN-polymérases et ARN-polymérases. Par exemple, l'ATP (adénosine triphosphate) est un substrat des ARN-polymérases, et le dCTP (désoxycytidine triphosphate) est un substrat des ADN-polymérases. La présence de est souvent requise comme cofacteur pour ces enzymes.

1.2 Structure des Acides Nucléiques

Les acides nucléiques sont des polymères de nucléotides liés par des liaisons phosphodiester entre le groupement phosphate 5' d'un nucléotide et le groupement hydroxyle 3' du sucre du nucléotide adjacent. Cela forme un squelette sucre-phosphate.

A) Taille des Polymères Nucléiques

La taille est exprimée en :

• Longueur.

• Masse moléculaire en Daltons (Da).

• Nombre de nucléotides (ou bases) :

  • b pour les molécules simple brin.

  • pb (paires de bases) pour les molécules double brin.

B) Polarité des Chaînes d'Acide Nucléique

Chaque brin d'ADN ou d'ARN possède une polarité définie par les extrémités 5' (phosphate libre) et 3' (hydroxyle libre). La synthèse s'effectue toujours dans le sens 5' vers 3'.

C) Description de l'ADN

L'ADN est une double hélice découverte par James Watson et Francis Crick en 1953.

• Elle est composée de deux chaînes de nucléotides antiparallèles (une orientée 5'->3' et l'autre 3'->5') et complémentaires.

• Les bases azotées sont tournées vers l'intérieur de l'hélice, formant des appariements par liaisons hydrogène (appariements Watson-Crick) :

  • Adénine (A) s'apparie avec la Thymine (T).

  • Guanine (G) s'apparie avec la Cytosine (C).

• Les squelettes sucre-phosphate sont tournés vers l'extérieur, ce qui les rend hydrophiles.

• L'ADN peut contenir des bases méthylées (modifications épigénétiques).

Règle de Chargaff (1940) : Quelle que soit l'origine de l'ADN, la quantité de purines est toujours égale à la quantité de pyrimidines (), et spécifiquement :
et . Ainsi, .

Structure Secondaire de l'ADN : L'enroulement des deux brins en une double hélice. Cet enroulement peut être droit (majoritaire, sens des aiguilles d'une montre) ou gauche (sens inverse). La conformation B de l'ADN est la plus courante et est une hélice droite.

D) Description de l'ARN

L'ARN est généralement une molécule à simple brin, mais il peut former des structures secondaires complexes par appariements intramoléculaires. L'Uracile (U) remplace la Thymine (T) dans l'ARN.

Types d'ARN :

• rRNA (ARN ribosomique) : Participe à la structure des ribosomes et catalyse la formation des liaisons peptidiques. Représente des ARN totaux.

• tRNA (ARN de transfert) : Transporteur d'acides aminés activés pour la traduction. Représente des ARN totaux.

• mRNA (ARN messager) : Produit de la transcription d'un gène, porte l'information à traduire en protéine. Représente des ARN totaux.

• ARN fonctionnels (ARNf) spécifiques :

  • snRNA (petits ARN nucléaires) : 100 à 200 bases, impliqués dans la maturation des ARNm (épissage) et ARNr.

  • snoRNA (petits ARN nucléolaires) : bases, impliqués dans la maturation des ARNr.

  • miRNA (micro ARN) : bases, régulation post-transcriptionnelle des ARNm cibles.

  • siRNA (petits ARN interférents) : bases, interférence ARN après exposition à un ARN étranger, complémentarité avec ARNm cibles.

  • Ribozymes : Certains ARN possèdent des propriétés catalytiques, agissant comme des enzymes. L'ARN ribosomique catalyse la formation de la liaison peptidique dans le ribosome.

E) Modifications et Lésions des Bases

L'ADN peut subir diverses lésions, souvent dues à des facteurs environnementaux ou des erreurs métaboliques.

• Lésions d'origine endogène : Désamination des bases, métabolisme oxydatif, alkylation.

• Lésions d'origine exogène :

  • Dimères de pyrimidines ou de purines : Liaisons covalentes entre bases adjacentes, causées par les radiations UV (ex: dimères de thymine).

  • Adduits d'hydrocarbures aromatiques polycycliques (ex: benzopyrène).

  • Adduits d'autres composés électrophiles attaquant l'azote 7 de la guanine (certains agents anticancéreux).

  • Coupures double brin : Radiations ionisantes, action des topoisomérases.

Il existe des mécanismes de réparation spécifiques pour ces lésions :

1.3 L'ADN Circulaire

Certains organismes (procaryotes, mitochondries, chloroplastes, plasmides) possèdent de l'ADN sous forme circulaire plutôt que linéaire.

1.4 La Chromatine

Chez les eucaryotes, l'ADN est étroitement empaqueté avec des protéines (histones) pour former la chromatine, qui constitue les chromosomes. Cette organisation permet un stockage compact et régule l'accès à l'ADN pour la transcription et la réplication.

2. Anatomie du Gène et Allèles

Un gène est une séquence d'ADN porteuse d'information pour la synthèse d'une protéine ou d'un ARN fonctionnel. Les allèles sont les différentes versions d'un même gène.

Chez les eucaryotes, la structure des gènes est discontinue :

• Exons : Séquences codantes qui seront traduites en protéines.

• Introns : Séquences non codantes, intercalées entre les exons, qui sont éliminées lors de l'épissage de l'ARN.

La transcription d'un gène comprend :

• Une région en amont (5'UTR) et en aval (3'UTR) des séquences codantes, non traduites, qui jouent un rôle régulateur.

• Un promoteur : Région en amont du premier exon, site de fixation de l'ARN polymérase et des facteurs de transcription, déterminant quel brin d'ADN sera copié. La séquence TATA box est un élément promoteur commun, mais inconstant, situé nucléotides en amont.

• Des séquences régulatrices éloignées : Enhancers (activateurs) ou Silencers (répresseurs), pouvant se trouver dans les introns ou en aval du dernier exon.

La transcription commence nucléotides en aval de la TATA box (si présente) et recopie le brin antisens (brin matrice 3'->5'). L'ARNm synthétisé est alors identique au brin sens (brin non transcrit 5'->3'), à l'exception du remplacement des T par des U.

La terminaison de la transcription est signalée par des séquences spécifiques en aval de la séquence codante, reconnues par l'ARN polymérase.

Il est important de noter que tous les gènes ne codent pas pour des protéines ; certains codent pour des ARN fonctionnels non traduits (ARNr, ARNt, micro-ARN, etc.).

3. Réplication de l'ADN

La réplication de l'ADN est le processus par lequel une molécule d'ADN est copiée pour produire deux molécules d'ADN identiques.

3.1 Définitions Élémentaires

• La réplication est semi-conservative : Chaque nouvelle molécule d'ADN est constituée d'un brin parental et d'un brin nouvellement synthétisé. (Démontré par Meselson et Stahl en 1957).

• La synthèse de l'ADN est polarisée : Elle se déroule toujours dans le sens 5' vers 3'.

• Elle repose sur l'appariement de bases complémentaires (A-T, G-C).

3.2 Mécanisme de la Réplication chez les Eucaryotes

• Asymétrie de la réplication : Liée à l'activité de l'ADN polymérase qui ne peut ajouter des nucléotides qu'à l'extrémité 3'-OH libre d'un brin d'ADN ou d'ARN préexistant (amorce).

• Nécessité d'une amorce : L'ADN polymérase a besoin d'une amorce dont le dernier résidu est apparié et possède un groupement 3'-OH libre. Cette amorce est synthétisée par une primase (ARN polymérase).

• Les nucléotides triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) et le sont essentiels.

A) Continuité et Discontinuité de la Réplication

En raison de son activité 5'->3' et de la nature antiparallèle de l'ADN, la réplication progresse différemment sur les deux brins :

• Sur le brin précoce (leading strand) : La synthèse est continue, dans le sens 5'->3', à mesure que la double hélice parentale est déroulée.

• Sur le brin retardé (lagging strand) : La synthèse est discontinue, sous forme de petits fragments appelés fragments d'Okazaki (1000 à 2000 pb). Chaque fragment est synthétisé dans le sens 5'->3', puis les fragments sont reliés entre eux par une ADN ligase.

B) Machinerie de la Réplication

La réplication implique un complexe de protéines :

• Topoisomérase II : Relâche les supertours en amont de la fourche de réplication.

• Hélicase : Déroule la double hélice d'ADN en rompant les liaisons hydrogène.

• Protéines RPA (Replication protein A) : Se fixent sur l'ADN simple brin pour stabiliser les brins séparés et prévenir leur réappariement.

• Primase : ARN polymérase qui synthétise les amorces ARN nécessaires à l'ADN polymérase.

• ADN polymérases :

  • Chez les eucaryotes, il existe plusieurs ADN polymérases à fonctions distinctes :

    • (POLA) : Synthétise l'amorce, débute l'élongation, et participe à la réparation.

    • : Principalement impliquée dans la réparation de l'ADN.

    • (POLG) : Réplication de l'ADN mitochondrial.

    • (POLD) : Élongation des brins (principalement le brin retardé) et réparation.

    • (POLE) : Réparation et remplacement de l'ARN sur le brin retardé (similaire à Pol ).

• RNase H : Élimine les amorces ARN.

• Ligase 1 (LIG1) : Joint les fragments d'Okazaki sur le brin retardé.

C) Unité de Réplication (Réplicon)

• Un réplicon est une zone d'ADN répliquée à partir d'une seule origine de réplication.

• Chez les procaryotes, il y a un réplicon unique (souvent circulaire).

• Chez les eucaryotes, il y a plusieurs origines de réplication, activées de manièresynchronisée et progressant à la même vitesse ( nucléotides/s), en raison de la plus grande taille de leur ADN linéaire.

D) Protéines Accessoires des ADN Polymérases (Eucaryotes)

• PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) : Puissant activateur de l'ADN polymérase et active aussi l'ADN polymérase .

• RF-A (Facteur de réplication A) : Se fixe sur l'ADN simple brin, indispensable à l'action des polymérases et . Impliqué dans la recombinaison.

• RF-C (Facteur de réplication C) : Se fixe sur l'ADN au niveau des zones d'amorces, possède une activité ATPasique (-dépendante) stimulée par PCNA et RF-A.

4. Transcription : De l'ADN à l'ARN

La transcription est le processus par lequel l'information génétique contenue dans l'ADN est copiée en une molécule d'ARN. C'est la première étape de l'expression génique.

4.1 Le Processus de la Transcription

• L'ARN polymérase utilise un brin d'ADN (appelé brin antisens ou brin ) comme matrice, qu'elle lit dans le sens 3' vers 5'.

• L'ARN synthétisé est alors complémentaire du brin antisens et identique au brin sens (brin ), à l'exception du remplacement des T par des U.

• La synthèse de l'ARN a lieu dans le sens 5' vers 3'.

La transcription se déroule en trois étapes principales :

1. Initiation : L'ARN polymérase reconnaît les séquences promotrices et commence la synthèse.

2. Élongation : L'ARN polymérase progresse le long du brin matrice, synthétisant l'ARN.

3. Terminaison : L'ARN polymérase rencontre des signaux de terminaison et libère l'ARN nouvellement synthétisé.

4.2 Transcription chez les Eucaryotes

Les génomes eucaryotes présentent des particularités qui influencent la transcription :

• Ils sont diploïdes.

• Ils sont éclatés ou en mosaïque (présence d'introns et d'exons).

• L'expression est compartimentée (noyau pour la transcription, cytoplasme pour la traduction).

• L'unité de transcription est monocistronique (un gène code une protéine ou un ARN fonctionnel).

A) Types d'ARN Polymérases eucaryotes

Quatre types d'ARN polymérases sont présentes chez les eucaryotes, chacune spécialisée :

• ARN polymérase I : Transcrit les ARN ribosomiques (ARNr) 18S, 5.8S, 28S.

• ARN polymérase II : Transcrit les ARN messagers (ARNm) et certains snRNA.

• ARN polymérase III : Transcrit les ARNt et l'ARNr 5S.

• ARN polymérase IV : Chez les plantes, spécialisée dans la transcription de l'ADN mitochondrial et la synthèse de l'hétérochromatine.

B) Modifications Post-Transcritptionnelles

Après la transcription, l'ARN primaire (pré-ARNm) des eucaryotes subit des modifications importantes :

• Coiffe en 5' : Ajout d'une 7-méthylguanosine inversée en 5', servant de signal d'initiation de la traduction (chez les eucaryotes).

• Polyadénylation en 3' : Ajout d'une queue poly-A (environ 50-250 adénines) à l'extrémité 3', améliorant la stabilité et la traduction de l'ARNm.

• Épissage : Élimination des introns et ligature des exons pour former l'ARNm mature. L'épissage est réalisé par le spliceosome, un complexe de snRNAs (U1, U2, U4, U5, U6) et de protéines sous forme de snRNP. Les séquences caractéristiques des introns sont 5' GU...A...AG 3'.

4.3 Inhibiteurs Spécifiques de la Transcription

Certaines molécules peuvent bloquer sélectivement la transcription :

• Groupe des Rifamycines (Rifampicine, Rifabutine) : Inhibent l'ARN polymérase bactérienne en se fixant sur la sous-unité .

• Actinomycines : Inhibent l'élongation en se fixant sur les paires de bases GC de l'ADN, bloquant ainsi la progression de l'ARN polymérase.

5. Traduction : De l'ARN aux Protéines

La traduction est le mécanisme par lequel l'information génétique portée par l'ARNm est convertie en une séquence spécifique d'acides aminés, formant une protéine.

5.1 Principe et Code Génétique

• La traduction est un passage d'un "alphabet à 4 lettres" (nucléotides) à un "alphabet à 20 lettres" (acides aminés).

• La synthèse protéique est polarisée : Elle se fait de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale du polypeptide, au niveau des ribosomes.

• Le code génétique est universel : Il est le même pour presque tous les êtres vivants, à quelques exceptions près (certains protistes, mitochondries).

• Le code génétique est dégénéré : Il comporte codons pour seulement acides aminés, ce qui signifie qu'un acide aminé peut être codé par plusieurs codons (souvent la différence se situe au 3^e nucléotide).

• Il existe aussi des codons stop (UAA, UAG, UGA) qui signalent la fin de la traduction.

5.2 L'ARN de Transfert (ARNt)

Les ARNt sont des molécules adaptatrices essentielles à la traduction :

• Ils possèdent une structure spécifique en feuille de trèfle.

• Ils ont deux zones importantes :

  • L'anticodon : Séquence de trois nucléotides, complémentaire et antiparallèle du codon de l'ARNm.

  • L'extrémité 3' : Site de fixation de l'acide aminé correspondant.

• Chaque ARNt est spécifiquement lié à l'acide aminé qu'il transporte par une enzyme appelée aminoacyl-tRNA synthétase (activation d'un acide aminé, coûte de l'ATP).

5.3 Étapes de la Traduction

La traduction se déroule en trois étapes :

1. Initiation :

   • Chez les eucaryotes, la coiffe en 5' de l'ARNm sert de point de repère pour le ribosome.

   • Le ribosome (petite sous-unité) et l'ARNt initiateur (portant la méthionine) se fixent à l'ARNm.

   • Le ribosome scanne l'ARNm jusqu'à trouver le premier codon de démarrage (AUG).

   • La grande sous-unité ribosomique s'assemble, formant un complexe d'initiation fonctionnel.

2. Élongation :

   • Les ARNt chargés s'introduisent successivement dans le site A du ribosome, s'appariant avec le codon de l'ARNm via leur anticodon.

   • La formation d'une liaison peptidique est catalysée par le peptidyltransférase (une activité de l'ARNr).

   • Le ribosome se déplace d'un codon (translocation), déplaçant les ARNt et l'ARNm le long du ribosome.

3. Terminaison :

   • Le ribosome rencontre un codon stop sur l'ARNm.

   • Des facteurs de libération reconnaissent le codon stop.

   • Le polypeptide fraîchement synthétisé est libéré, et le complexe ribosomique se dissocie.

Tableaux des Abréviations des Acides Aminés et du Code Génétique :

6. Outils et Techniques de la Biologie Moléculaire

La biologie moléculaire utilise un large éventail de techniques pour étudier les acides nucléiques et les protéines.

6.1 Purification des Acides Nucléiques

Avant toute analyse, il est souvent nécessaire d'extraire et de purifier l'ADN ou l'ARN des cellules.

• Échantillon : Plasma, sérum, sang total, ou tissu.

• Lyse cellulaire : Utilisation de détergents pour rompre les membranes cytoplasmiques et nucléaires.

• Séparation : Centrifugation pour séparer les lipides des acides nucléiques (qui restent dans le surnageant).

• Capture : Utilisation de silice ou de mini-colonnes spécifiques pour isoler l'ARN/ADN.

• Élimination des protéines : Ajout de tampons de lavage et/ou d'enzymes comme la protéinase K pour dégrader les protéines contaminantes.

• Précipitation : Précipitation des acides nucléiques avec de l'éthanol.

• Élution : Resuspension des acides nucléiques purifiés dans de l'eau distillée ou un tampon d'élution.

6.2 Électrophorèse sur Gel

L'électrophorèse est une technique fondamentale pour séparer des molécules chargées (ADN, ARN, protéines) en fonction de leur taille et de leur charge.

• Principe : Les molécules chargées (majoritairement négativement en milieu basique) migrent sous l'effet d'un champ électrique à travers une matrice (gel) vers l'anode (). Les molécules plus petites migrent plus rapidement et plus loin.

• Matrices :

  • Gel d'agarose : Utilisé pour les acides nucléiques (ADN ou ARN), moins toxique que l'acrylamide. L'agarose est un polymère purifié d'agar. Des puretés élevées sont utilisées pour l'extraction post-migration.

  • Gel de polyacrylamide : Utilisé pour les petites molécules d'ADN/ARN et les protéines.

• Concentration d'agarose : La concentration du gel influence la gamme de tailles idéales séparables.

  Concentration d'agarose (%, g/100 ml)	Gamme de tailles idéales (en kb)
  0.3	5 – 60
  0.6	1 – 20
  0.7	0.8 – 10
  0.9	0.5 – 7
  1.2	0.4 – 6
  1.5	0.2 – 3
  2.0	0.1 – 2

• Visualisation : Les acides nucléiques migrés sont visualisés grâce à des agents intercalants fluorescents exposés aux UV.

  • Bromure d'éthidium (BET) : Très utilisé, mais toxique et mutagène.

  • Alternatives moins dangereuses : SYBR Green I (double brin), SYBR Green (simple brin), GelRed, GelGreen.

• Marqueurs de taille : Une échelle de marqueurs (DNA ladder) est utilisée pour estimer la taille des fragments d'intérêt.

• Southern blot : Technique de transfert (buvardage) d'ADN depuis un gel d'agarose vers une membrane, suivie d'une hybridation avec des sondes spécifiques pour détecter des séquences d'ADN particulières.

• Western blot (protéines) et Northern blot (ARN) sont des techniques similaires pour d'autres macromolécules.

06.3 PCR (Polymerase Chain Reaction) ou Amplification en Chaîne par Polymérase

La PCR est une technologie révolutionnaire qui permet d'amplifier (copier en grand nombre) une séquence d'ADN connue à partir d'une très faible quantité d'ADN. Inventée par Kary Mullis (Prix Nobel en 1993).

• Objectif : Obtenir une quantité suffisante d'un fragment d'ADN cible pour le détecter ou l'analyser.

• Applications : Santé (diagnostic), criminalistique, archéologie, identification d'espèces ou d'individus.

• Avantages : Rapide (plus d'un milliard de copies en moins d'une heure), sensible.

A) Composants Nécessaires à une PCR

• Une matrice d'ADN : L'ADN à amplifier.

• dNTPs : Désoxyribonucléotides triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), les "briques" de l'ADN.

• ADN polymérase thermostable : Généralement la Taq polymérase, isolée de la bactérie thermophile Thermus aquaticus. Elle résiste aux hautes températures nécessaires à la dénaturation de l'ADN. Elle possède une activité exonucléase 5'->3' mais pas 3'->5' (pas de correction d'erreurs). D'autres polymérases (Pfu, Vent) sont utilisées.

• Tampon de réaction : Contient les sels, le pH optimal et le cofacteur .

• Amorces (primers) : Deux oligonucléotides spécifiques (environ 18-25 bases) qui délimitent la région à amplifier et servent de point de départ pour l'ADN polymérase (fournissent le 3'-OH libre).

  • Ils doivent être spécifiques et ne pas s'apparier entre eux.

  • Leur séquence dépend de la connaissance des séquences flanquantes de la région cible.

• Un thermocycleur : Appareil qui contrôle précisément et cycliquement les températures.

B) Les Trois Étapes Cycliques de la PCR

Chaque cycle de PCR comprend trois étapes à des températures spécifiques :

1. Dénaturation () : Le double brin d'ADN matrice est séparé en deux brins simples par la chaleur, rompant les liaisons hydrogène.

2. Hybridation (Annélation) des amorces (entre et , dépend du Tm) : Les oligonucléotides amorces s'hybrident spécifiquement aux séquences complémentaires sur les brins simples d'ADN.

   • Le Tm (Melting Temperature) est la température à laquelle de l'ADN est sous forme simple brin. Il dépend de la longueur et de la composition en GC (plus le %GC est élevé, plus le Tm est élevé). Formule approximative pour .

3. Élongation (Extension) () : L'ADN polymérase (Taq) synthétise un nouveau brin d'ADN à partir des amorces, en ajoutant des dNTPs dans le sens 5'->3'.

Après cycles, le nombre de copies d'ADN est amplifié de façon exponentielle selon la formule : ( = nombre de molécules initiales). Typiquement, à cycles sont réalisés, permettant d'atteindre jusqu'à amplicons.

C) Types de PCR

• PCR conventionnelle :

  • Qualitative (détection de la présence/absence d'une séquence).

  • La détection des produits de PCR se fait par électrophorèse sur gel d'agarose avec marquage au Bromure d'Ethidium.

• PCR en temps réel (qPCR) :

  • Qualitative et quantitative.

  • Permet de suivre la formation des amplicons pendant que la réaction se déroule sur un automate.

  • Utilise des molécules fluorescentes dont l'émission est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons formés.

  • Mesure le Ct (Cycle seuil) : le cycle auquel la fluorescence devient détectable. Le Ct est inversement proportionnel à la quantité de matrice initiale.

  • Diminue le risque de contamination post-PCR car les tubes ne sont pas ouverts après l'amplification.

  • Chimies de détection :

    • Agents intercalants (ex: SYBR Green) : Se fixent à tout ADN double brin. Avantage : simple, mais désavantage : non spécifique (peut se fixer sur des dimères d'amorces).

      • À (dénaturation), l'ADN est simple brin, SYBR Green ne se fixe pas, pas de fluorescence.

      • À (hybridation), amorces se fixent, SYBR Green peut commencer à se fixer.

      • À (élongation), ADN polymérase synthétise, plus de SYBR Green se fixe.

      • À la fin de l'élongation, l'ADN est double brin, SYBR Green se fixe abondamment et émet de la fluorescence sous excitation lumineuse.

    • Sondes d'hybridation (ex: TaqMan, Molecular Beacon) : Spécifiques à la séquence cible. Elles se basent souvent sur le principe FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), avec un fluorochrome rapporteur (reporter) et un suppresseur (quencher).

      • Sonde TaqMan : Entre pb, marquée au 5' par un reporter et au 3' par un quencher. Lorsque la polymérase avance et rencontre la sonde hybridée à la cible, son activité exonucléasique 5'->3' hydrolyse la sonde. Le reporter est alors libéré du quencher et émet de la fluorescence. Permet la PCR multiplex (plusieurs cibles dans un même tube avec des fluorochromes différents).

      • Molecular Beacon : Possède une structure en épingle à cheveux. À l'état libre, le reporter et le quencher sont proches, et pas de fluorescence. Quand la sonde s'hybride à la cible, la structure s'ouvre, séparant reporter et quencher, entraînant une émission de fluorescence.

    • Amorces fluorescentes (ex: Scorpion, LUX, Plexor).

• RT-PCR (Reverse Transcription PCR) :

  • Utilisée pour détecter des cibles ARN (ex: ARN viral, ARNm).

  • Comprend une première étape de rétrotranscription (Reverse Transcription) catalysée par une reverse transcriptase, qui convertit l'ARN en ADN complémentaire (ADNc).

  • Ensuite, les étapes classiques de la PCR (conventionnelle ou en temps réel) sont réalisées sur l'ADNc.

• PCR multiplex : Amplification de plusieurs cibles dans un même tube. Nécessite des sondes spécifiques et fluorophores différents pour la qPCR, ou des amplicons de tailles différentes pour la PCR conventionnelle.

• PCR imbriquée (Nested PCR) : Utilise deux paires d'amorces successives. La première paire amplifie une région plus large, puis la seconde paire (interne à la première) amplifie une séquence plus spécifique. Augmente la sensibilité et la spécificité, utile pour les virus à ARN à haute mutabilité.

D) Contamination en PCR

La haute sensibilité de la PCR la rend très sujette à la contamination. Des mesures strictes sont nécessaires :

• Laboratoire divisé en 3 salles : Extraction, préparation des réactifs, amplification/détection.

• Détection des produits si les tubes sont ouverts doit se faire dans une salle séparée.

• Ne pas réutiliser les réactifs, jeter les réactifs contaminés.

• Utiliser des gants sans poudre et une blouse dédiée à chaque salle.

6.4 Autres Méthodes d'Études des Gènes

• Hybridation in situ : Détection de séquences d'ADN ou d'ARN directement dans les cellules ou les tissus. La FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) utilise des sondes fluorescentes. L'Hybridation Génomique Comparative (CGH-array) détecte les variations du nombre de copies de fragments d'ADN.

• Séquençage du génome : Détermination de l'ordre d'enchaînement des nucléotides dans un fragment d'ADN ou un génome entier.

• Micromatrices / Puces à ADN : Permettent d'étudier l'expression de milliers de gènes simultanément, en testant une banque de molécules sur des plaques microtitres.

7. Culture Cellulaire

La culture cellulaire est un ensemble de techniques permettant de faire croître des cellules hors de leur organisme d'origine (ex vivo).

7.1 Origine et Préparation des Cellules

• Cellules sanguines : Proviennent du sang, sont non jointives. Peuvent être séparées par centrifugation sur gradient de densité (ex: Ficoll).

• Cellules d'organes :

  • À partir d'un fragment de tissu : Les cellules migrent à partir du fragment et se développent à la surface du support de culture.

  • À partir d'une fragmentation de l'organe : Le tissu est dissocié mécaniquement et/ou enzymatiquement (ex: trypsine pour couper les ponts protéiques intercellulaires) pour obtenir une suspension cellulaire.

• Les cellules sont ensuite mises en culture primaire. Quand la culture prolifère et occupe tout le support, elle est repiquée (dissociée à nouveau et diluée) en culture secondaire.

7.2 Types de Lignées Cellulaires

• Lignées primaires : Cellules isolées directement d'un tissu. Elles ont les caractéristiques des "vraies cellules", mais une durée de vie limitée (finissent par entrer en sénescence ou apoptose).

• Cellules "immortalisées" : Leur durée de vie est prolongée artificiellement par l'infection par un virus (ex: Lymphocytes B par EBV, fibroblastes par SV40) ou par l'introduction d'oncogènes.

• Cellules tumorales : Peuvent être prélevées directement chez un patient (ex: lignée HeLa) ou être des cellules transformées artificiellement par un oncogène. Ces cellules ont la capacité de se diviser indéfiniment.

7.3 Conditions de Culture

Pour réussir une culture cellulaire, des conditions strictes sont nécessaires :

• Stérilité : Travail en hotte à flux laminaire pour éviter la contamination.

• Flacons de culture : Supports adaptés à la croissance des cellules.

• Étuves aérobies : Permettent de contrôler précisément la température () et la pression en (souvent ).

• Milieux de culture adéquats : Contiennent les nutriments, facteurs de croissance, sels, et tampons nécessaires à la survie et la prolifération cellulaire.

7.4 Applications de la Culture Cellulaire

• Recherche fondamentale : Étude des mécanismes cellulaires, test de nouvelles molécules.

• Industrie : Toxicologie, études pharmacologiques.

• Études chromosomiques : Caryotype fœtal (diagnostic prénatal).

• Thérapie cellulaire : Production de peau neuve par culture pour autogreffe (grands brûlés).

• Virologie : Culture de virus pour la production de vaccins ou le diagnostic (marquage au bleu de Coomassie pour protéines).