Bases cellulaires du développement

I - Introduction à la biologie du développement

A. Le Xénope, un modèle de choix

Le xénope est un batracien d'Afrique duSud, modèle d'étude privilégié en embryologie pour ses caractéristiques suivantes :

• Diamètre d'environ 0,9 mm :visible à l'œil nu, permettant des injections multiples (électrodes, pipettes pour facteurs de transcription).
• Bicolore.
• Fécondation externe : le développement est facilement observable et manipulable en laboratoire.
• Monospermique : après l'entrée d'un spermatozoïde, formation d'une membrane de fécondation et exocytose de granules corticaux empêchant l'entrée d'autres spermatozoïdes.

Le xénope est utilisé :

• Au stade d'ovocyte immature (bloqué enprophase I de méiose).
• Au stade d'ovocyte mature (bloqué en métaphase II), fécondable, où un point blanc indique la rupture de la vésicule germinative et l'entrée en méiose II.

L'ovocyte présente deux pôles :

• Le pôle végétatif (clair) : contient les réserves vitellines.
• Le pôle animal (sombre) : contient le noyau.

B. Développement de l'ovocyte de Xénope

Ledéveloppement de l'ovocyte fécondé suit plusieurs étapes :

1. Segmentation : premières divisions sans augmentation de volume.
2. Stade morula : ressemble à une mûre.
3. Stade blastula : lorsque le nombre de cellules est tropélevé pour être compté.
4. Gastrulation :
   • Initiée par la blastocèle (cavité).
   • Mise en place des trois feuillets embryonnaires :
     • Ectoderme :tissu le plus externe, une partie deviendra le neurectoderme.
     • Mésoderme : tissu intermédiaire, à l'origine du squelette et des muscles.
     • Endoderme : feuillet le plus interne (ventral), à l'origine du système digestif.
5. Neurulation :
   • Mouvements des territoires embryologiques pour créer la plaque neurale.
   • Différenciation d'un tube nerveux dorsal (futur système nerveux, moelle épinière, cerveau).
6. Têtard : stade pré-adulte, mobile, utilisant les réserves vitellines.
7. Métamorphose : transformation en xénope adulte.

C. La Fécondation

Le spermatozoïde pénètre l'ovocyte dont le potentiel de membrane est proche de 0mV. Après la reformation de la membrane, la polarité de l'ovocyte redevient -60mV, créant une répulsion électrostatique.

• Lepoint d'impact du spermatozoïde est crucial.
• Rotation de 30° du cytoplasme superficiel (calotte pigmentée).
• Apparition du croissant gris (zone intermédiaire de pigmentation) à l'opposé de l'impact, représentant la futurerégion dorsale.
• Le point d'entrée du spermatozoïde marque la future région ventrale.
• Établissement d'un nouvel axe dorso-ventral.

La rupture de la vésicule germinative libère les chromosomes, permettant leurrencontre lors de la fécondation.

II - Dorsalisation de l'embryon

A. Le Croissant Gris

Le croissant gris contient des facteurs dorsalisants.

Expérience n°1	Ligature des cellules austade blastula, répartition symétrique du croissant gris.
Observations	Deux embryons jumeaux viables se développent normalement.
Expérience n°2	Séparation non symétrique, lecroissant gris entier dans une seule cellule.
Observations	Un embryon normal et une "belly piece" (pièce ventralisée), sans axe dorso-ventral ni système nerveux, uniquement des cellules épidermiques, mésenchymateuses et endodermiques.
Conclusion	L'absence de croissant gris entraîne une ventralisation totale de l'embryon.

Les expériences au stade 4 cellules confirment ces résultats : un embryon totalement ventralisé ne se développe pas, contrairementà un embryon dorsalisé.

B. Le Centre de Newkoop

Au stade 32 cellules, le centre de Newkoop est une région dorsalisante.

Expérience n°1	Greffe du centre de Newkoopd'un embryon donneur au pôle végétatif ventral d'un embryon receveur.
Observations	Obtention d'un embryon double ("siamois") avec deux cerveaux, deux moelles épinières, deux systèmesoculaires. Le système nerveux se développe dans une région ventralisée.
Conclusion	Les cellules de Newkoop contiennent des informations (protéines) qui induisent la formation des neurones et la différenciation en tissu nerveux, provoquant une dorsalisation.

Les expériences sur les embryons de xénopes ont un taux d'échec élevé (80%) en raison de leur fragilité.

III - Transmission des messages de développement

A. Principe

Les cellules émettrices sécrètent des informations (ex: protéines) que les cellules réceptrices doivent capter via des récepteurs protéiques spécifiques pour induire une réponse. Les messages peuvent avoir trois effets principaux :

• Prolifération : maintenir l'état de cellule souche.
• Différenciation : orienter la cellule souche vers un type cellulaire spécifique.
• Sécrétion d'un message informatif (protéine de développement).

B. Molécules du développement

1) Moléculesde signalisation

Les molécules "inductrices" déclenchent des programmes de développement. Exemples :

• EGF (Epidermal Growth Factor)
• VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) : développement de l'endothélium vasculaire.
• IGF (Insulin-like Growth Factor) : rôle dans le système nerveux.
• NGF (Nerve Growth Factor) : différenciation des cellules nerveuses.
• TGFβ (Transforming Growth Factorsbeta) : peut transformer des cellules souches en cellules nerveuses.

Attention : le nom d'un facteur de croissance ne limite pas son action à un seul organe ou fonction.

2) Facteurs de transcription

La liaison d'un ligand à son récepteur peut créerou activer un facteur de transcription. Cela entraîne :

1. Activation de la synthèse d'ADN.
2. Activation de l'expression de la protéine d'intérêt.

Cette protéine peut ensuite induire prolifération, différenciation,ou sécrétion d'un message. Les voies de signalisation sont complexes et permettent une régulation fine et une redondance essentielle en cas de mutation.

IV - Mise en place de l'axe dorso-ventral

La dorsalisation (ou neurulation) de l'embryon implique l'allongement selon l'axe antéro-postérieur et la mise en place de l'axe dorso-ventral, définissant par exemple la position de la moelle épinière (dorsale).

A. Tsh3, molécule inductrice de la dorsalisation

XTsh3 (Xenopus teashirt 3) est une molécule inductrice d'organisation, possédant un domaine en "doigt de zinc" caractéristique des facteurs de transcription.

Expérience n°1 : Hybridation In-Situ (HIS)	Utilisation d'une sonde fluorescente d'ADN monocaténaire pour localiser l'ARNm de Tsh3.
Observations	Le marquage est localisé uniquement dans la région dorsale (futurs hémisphères cérébraux, moelle épinière,colonne vertébrale).
Conclusion	Tsh3 est un candidat potentiel pour l'induction de la neurulation.

Pour prouver l'implication de Tsh3 dans la dorsalisation, un inhibiteur (Tsh3MO) est utilisé :

Expérience n°2	Injection dorsale de Tsh3MO.
Observations	Arrêt du développement, pas de différenciation en tissu nerveux,ventralisation de l'embryon, non viable.
Expérience n°3	Injection ventrale de Tsh3MO.
Observations	Développement normal.
Conclusion	Tsh3MO n'est pas toxique globalement et bloque spécifiquement Tsh3. Il ne diffuse pas entre les compartiments ventral et dorsal. La région dorsale contient des cellules réceptives à Tsh3.

B.Tsh3 provoque la translocation de la β-caténine dans le noyau

La β-caténine (β-cat), un facteur de transcription, est également localisée dans la zone dorsale. Tsh3 semble contrôler sa localisation nucléaire.

Expérience n°1	Immunofluorescence pour suivre β-cat en présence de Tsh3. Colocalisation avec le marquage nucléaire (noyau jaune).
Groupe Témoin (sans Tsh3)	Noyaux orange(β-cat absente du noyau).
Groupe Test (avec Tsh3)	Fluorescence jaune dans le noyau (β-cat présente dans le noyau).
Conclusion	Tsh3 induit la translocation de la β-caténine dans le noyau.
Expérience n°2	Étude de l'interaction entre Wnt et Tsh3.
Groupe Témoin (avecWnt)	Wnt envoie la β-cat dans le noyau (fluorescence jaune).
Groupe Test (avec Wnt et Tsh3MO)	Wnt ne peut plus envoyer β-cat dans le noyau (fluorescence orange).
Conclusion	Wnt a besoin de Tsh3 pour exercer son effet. Il existe un dialogue entre les deux voies de signalisation, impliquant des protéines cytoplasmiques communes.

Un Western blot amontré que Wnt induit la synthèse de β-caténine. L'injection de β-caténine dans le centre de Newkoop induit une dorsalisation et la formation d'embryons doubles (siamois).

Schéma récapitulatif :

• Impact du spermatozoïde → Rotation du cytoplasme cortical → Croissant gris.
• Croissant gris → Facteurs dorsalisants → Centre de Newkoop.
• Centre de Newkoop → Wnt/Tsh3 → Translocation de β-caténine dans le noyau →Dorsalisation.

C. Action moléculaire de Wnt

Wnt possède deux récepteurs : Frizzled et LRP.

• Sans Wnt : la β-caténine est phosphorylée (par GSK3β)et séquestrée dans le cytoplasme avec un complexe de protéines (APC, Axin). Le complexe est dégradé par ubiquitination. De plus, des protéines comme Groucho répriment la transcription des gènes cibles de β-caténine.
• Avec Wnt : Wnt selie à Frizzled et LRP, entraînant la dissociation du complexe de séquestration (CK1α, GSK, Axin...). La β-caténine est déphosphorylée et migre dans le noyau. La protéine Dsh (Dishevelled) favorise la libération deβ-caténine. Cette migration induit la transcription de nombreux gènes, dont celui de Chordin (à l'origine de la chorde).

L'injection de Dsh du côté ventral peut induire le développement d'un second système dorsal, prouvant que les cellules possèdentles molécules, mais leur expression ou localisation est régulée.

D. Action du Lithium

Les sels de lithium sont des oligoéléments qui peuvent induire une hyperdorsalisation.

• Le lithium inhibe la GSK3βqui, en l'absence de ligand, séquestre β-caténine en la phosphorylant.
• L'inhibition de GSK3β libère une grande quantité de β-caténine qui rejoint le noyau, entraînant une cascade d'activation et la dorsalisation (neurulation).

Le lithium est utilisé comme régulateur de l'humeur en raison de ses effets sur le système nerveux. L'excès d'UV empêche la dorsalisation des embryons. Le traitement au lithium (injection ou concentration élevée dans le milieu) restaure la dorsalisation et le développement normalde l'embryon.

Schéma actualisé :

• Impact du spermatozoïde / Lithium → Rotation du cytoplasme cortical → Croissant gris.
• Croissant gris → Facteurs dorsalisants → Centre de Newkoop.
• Centre de Newkoop → Wnt/Tsh3 → Inhibition de GSK3β → Déphosphorylation de β-caténine → Translocation de β-caténine dans le noyau → Dorsalisation.

V - BMP4, une protéine multifonction

A. Chordin empêche BMP4 d'agir

BMP4 (Bone Morphogenesis Protein 4) est impliquée dans la morphogenèse des os.

• Sous forme activée, BMP4 se lie à son récepteur (sérine/thréonine kinase), induisant la phosphorylation de R-Smad.
• R-Smad interagit avec Co-Smad pour inhiber les gènes de différenciation nerveuse et activer la différenciation en épiderme (côté ventral).
• Chordin séquestre BMP4 par interaction protéine-protéine(liaison aux résidus cystéines CR1, CR3, CR4).
• Le complexe BMP4-Chordin ne peut plus se fixer au récepteur de BMP4, inhibant son action.

Chordin induit la dorsalisation en inhibant l'action de BMP4. Les neurones apparaissent "par défaut" en l'absence d'action de BMP4. Côté ventral, Wnt est séquestré hors de la cellule par d'autres protéines, ce qui entraîne :

1. Pas de fixation de Wnt à ses récepteurs.
2. Pas d'augmentation de β-caténine.
3. Pas de formation de Chordin.
4. BMP4 est actif.
5. Inhibition des gènes de différenciation nerveuse et activation de la différenciation épidermique = Ventralisation.

Schéma actualisé :

• Impact du spermatozoïde / Lithium → Rotation du cytoplasme cortical → Croissant gris.
• Croissant gris → Facteurs dorsalisants → Centre de Newkoop.
• Centre de Newkoop → Wnt/Tsh3 → Inhibition de GSK3β → Déphosphorylation de β-caténine → Translocation de β-caténine dans le noyau → Expression de Chordin.
• Chordin → Séquestration de BMP4 → Inhibition de la différenciation épidermique → Dorsalisation (apparition des neurones).

B. BMP4 induit le développement du cartilage

BMP4 (avec d'autres signaux) induit la différenciation en chondrocytes (cellules du cartilage). La suppression (KO) des récepteurs BMP (ou de Hoxa10) conduità des anomalies squelettiques, comme l'absence de côtes.

C. D'autres utilités de BMP chez l'adulte

L'hippocampe est une région cérébrale impliquée dans la mémoire et l'apprentissage, caractérisée par une forte plasticité.

Expérience	Souris entraînées à la course. Quantifications de BMP4 et Noggin dans l'hippocampe.
Observations	Les souris les plus entraînées montrent une augmentationde PCNA (marqueur de prolifération), une augmentation de Noggin et une diminution de BMP4.
Conclusion	L'entraînement favorise la neurogenèse (création de nouveaux neurones).

• Une surexpression de Noggin chez une souris au repos mime les effets de l'exercice.
• Une surexpression de BMP4 réduit la quantité de neurones dans l'hippocampe.

BMP4agit comme un frein au développement neuronal. L'entraînement induit l'augmentation de Noggin, qui inhibe BMP4, permettant la neurogenèse adulte à partir de cellules souches neuronales et augmentant la plasticité cérébrale.

VI - Le développement des muscles squelettiques

A. Généralités

Les muscles squelettiques dérivent du mésoderme.

• Phase de prolifération : production de myocytes primaires.
• Phase de différenciation : formation de myocytes secondaires qui donneront les fibres musculaires.

Un muscle mature est un syncytium (fusion de cellules plurinucléées). En cas d'altération musculaire, des cellules souches se différencient comme lors de l'embryogenèse. Il existe des marqueurs de différenciation musculaires (précoces, tardifs, transitoires) qui sont des outils essentiels pour l'étude. La formation du tube neural est suivie par celle du squelette et des muscles dorsaux.

B. La Tropomyosine

Les tropomyosines sont des molécules caractéristiques des muscles.

Expérience	Hybridation in-situ pour détecter les transcrits de tropomyosine.
Observations	Transcrits de β-TMad (gènemusculaire adulte) : exprimés uniquement à la fermeture du tube neural. Transcrits TMα7 : exprimés seulement dans les fibres primaires. Transcrits TMα2 : exprimés dans les fibres primaires et secondaires.

C. Signaux proliférateurs

Les signaux proliférateurs sont des molécules qui favorisent la prolifération cellulaire. L'effet de FGF6 sur la lignée musculaire C2C12 (qui ne l'exprime pas normalement) est étudié.

Expérience n°1	Expression permanente de FGF6 dans les cellules C2C12 (devenant C2CF6) par injection d'ARNm.
Observation 1	Quantité de FGF6 augmente avec le temps de culture.
Observation 2	Les cellules C2CF6 restent à l'état indifférencié et prolifèrent.
Conclusion	FGF6 envoie des signaux proliférateurs.

Expérience n°2	Mesure des ARNm (MyoD, Myf5, myog) par qRT-PCR.
Observations	Moins de facteurs de différenciation musculaire lorsque FGF6 est exprimé.
Expérience n°3	Observations des protéines (MyoD, Myf5, myog) par Western Blot.
Observations	Diminution de MyoD, myog, et Myf5 en présence de FGF6. L'inhibiteur de FGF6 (SU5402) entraîne la différenciation des cellules musculaires.

Expérience n°4	Étude de l'effet de FGF6 sur la synthèse de Mdr1 (protéine de résistance multidrogue).
Observations	FGF6 stimule la synthèse de Mdr1 (protéine ATPasique de la famille ABC).
Conclusion	Le rôle physiologique de Mdr1 n'est pas clair, mais pourrait protéger les cellules de l'apoptose et soutenirla prolifération. FGF6 pourrait agir via Mdr1 pour maintenir la prolifération.