Analyse chromosomique et FISH

Méthodes d'Analyse des Chromosomes

La cytogénétique est l'étude des chromosomes et de leurs anomalies. Elle s'appuie sur diverses méthodes pour analyser le matériel génétique.

Le Caryotype Métaphasique

Le caryotype métaphasique est une représentation morphologique de l'ensemble des chromosomes d'une cellule en métaphase, obtenue par microphotographie optique. Il permet d'observer le matériel héréditaire à un instant précis du cycle cellulaire, sans analyser le contenu génique lui-même.

Étapes de Réalisation du Caryotype

1. Obtention de Cellules en Division:
   • Culture cellulaire: Nécessite la mise en culture de cellules pendant 48 à 72 heures. Les plus couramment utilisées sont les lymphocytes sanguins, stimulés par une leptine mitogène comme la Phytohémagglutinine (PHA). D'autres sources incluent les fibroblastes (1 à 3 semaines), les cellules amniotiques (6 à 10 jours), et les cellules du trophoblaste.
   • Le processus implique une culture cellulaire, suivie d'une multiplication des lymphocytes.
2. Obtention de Métaphases Analysables:
   • Blocage des divisions cellulaires: Les cellules sont bloquées en métaphase par la colchicine, qui agit sur l'appareil fusorial.
   • Choc hypotonique: Une solution hypotonique disperse les chromosomes.
   • Fixation: Les préparations sont fixées avec un mélange méthanol/acide acétique.
   • Étalement sur lames: Les chromosomes sont étalés pour l'observation.
   
3. Identification des Chromosomes:
   • Coloration au Giemsa: Une coloration homogène permet de classer les chromosomes par taille et indice centromérique.
   • Méthodes de marquage: Les plus utilisées sont les bandes G (dénaturation enzymatique) et les bandes R (dénaturation thermique). Ces bandes transversales, spécifiques à chaque paire, permettent de visualiser 300 à 500 bandes par lot haploïde, avec une résolution d'environ 5 Mb.
   • Chaque bras chromosomique est divisé en régions et bandes numérotées du centromère au télomère (ex: 6p21 pour le gène HLA).
4. Classement des Chromosomes: Les chromosomes sont classés par paires selon leur taille et leur morphologie.

Indications du Caryotype

• Période prénatale: Antécédents d'anomalies, DPNI positif, signes échographiques, risque sérique élevé.
• Nouveau-né et enfant: Ambiguïté sexuelle, polymalformations, retard mental, dysmorphie, retard de croissance (chez la fille), impubérisme, maladies cassantes (ex: anémie de Fanconi).
• Adulte: Aménorrhée, anomalies du spermogramme, hypogonadisme, maladie abortive, leucémies, bilan de procréation médicalement assistée.

Anomalies Chromosomiques

• Constitutionnelles: L'anomalie est présente dans toutes les cellules (sauf mosaïcisme) et est survenue avant ou peu après la fécondation.
• Acquises: L'anomalie affecte un seul organe (anomalie clonale).
• Homogènes: Toutes les cellules du tissu examiné présentent la même anomalie.
• En mosaïque: Plusieurs populations cellulaires coexistent, certaines avec l'anomalie, d'autres normales (ex: mos 47,XY,+21[16]/46,XY[6]).

La nomenclature des anomalies chromosomiques est régie par l'ISCN (International Standing Committee for Human Cytogenetic Nomenclature).

Cytogénétique Moléculaire

Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH)

La FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) est une technique moléculaire complémentaire du caryotype.

• Elle est plus résolutive que le caryotype (résolution ≈ 3 Mpb) mais est ciblée, nécessitant l'utilisation de sondes fluorescentes spécifiques d'une région chromosomique donnée.
• Principe: Basé sur la capacité de l'ADN double brin à se dénaturer et se renaturer. Une sonde d'ADN marquée par un fluorochrome s'hybride spécifiquement à sa séquence complémentaire sur les chromosomes dénaturés.
• Applications: Peut être réalisée sur lymphocytes, moelle osseuse, coupes de tissus, ou cellules de divers prélèvements (sperme, liquide amniotique).
• Analyse: Se fait au microscope à fluorescence avec des filtres adaptés aux fluorochromes. L'absence de fixation de la sonde peut indiquer une délétion.
• Types de sondes: Centromériques, de peinture chromosomique, subtélomériques, ou spécifiques d'un locus.
• Exemple d'application clinique: Diagnostic du syndrome de Williams, causé par une microdélétion 7q11.23, caractérisé par sténose supravalvulaire aortique, aisance sociale paradoxale, dysmorphie faciale et déficience intellectuelle.

Analyse Chromosomique sur Puce à ADN (ACPA) ou CGH-array

L'ACPA (Analyse Chromosomique sur Puce à ADN), aussi appelée CGH-array, permet de détecter les anomalies chromosomiques en perte ou en gain (microdélétions et microduplications), avec une résolution environ 100 fois supérieure au caryotype.

• Elle permet d'identifier les variations de nombre de copies de l'ADN (CNV - Copy Number Variation).
• Principe:
  1. Marquage de l'ADN du patient (ex: vert) et de l'ADN témoin (ex: rouge) avec des fluorochromes différents.
  2. Hybridation simultanée des deux ADN marqués sur une puce à ADN contenant des fragments d'ADN spécifiques de différentes régions du génome.
  3. Analyse des intensités de fluorescence par scanner et calcul de ratios.
• Interprétation des résultats: Un ratio Vert/Rouge = 1 indique une quantité égale d'ADN patient et témoin. Un ratio suggère une délétion, et un ratio une duplication.
• Les CNVs sont classés en bénins, pathogènes ou variants de signification inconnue (VOUS) en utilisant des bases de données comme DECIPHER ou OMIM.
• Limites: L'ACPA ne détecte pas les anomalies chromosomiques équilibrées, les mutations ponctuelles, ni les mosaïques en dessous d'un certain seuil (10-20%).
• Un consensus scientifique reconnaît l'ACPA comme un test diagnostique de première intention pour les individus présentant des troubles du développement ou des anomalies congénitales.