Acides aminés, protéines et enzymologie : support de cours L1SpS UE2

Acides Aminés, Protéines, Enzymologie

Ce chapitre aborde les constituants fondamentaux du vivant : les acides aminés, leurs polymères les protéines, et les enzymes qui catalysent les réactions biologiques.

Les Éléments de Base : Les Acides Aminés

Les acides aminés (AA) sont les monomères constitutifs des protéines. Ils possèdent une structure générale commune et des propriétés physico-chimiques variées.

Structure Générale d'un Acide α-Aminé

• Chaque acide α-aminé possède un carbone α central lié à :
  • Un groupe amine (NH₂)
  • Un groupe carboxyle (COOH)
  • Un atome d'hydrogène (H)
  • Une chaîne latérale variable, appelée radical (R)
• Le carbone α est asymétrique (chiral) pour tous les AA sauf la glycine (où R=H).
• Les acides α-aminés naturels sont majoritairement de la série L (conformation S du carbone α).

Propriétés des Acides Aminés

• Les AA existent sous forme d'ions dipolaires (zwitterions) à pH physiologique, avec un groupe amine protoné (NH₃⁺) et un groupe carboxyle déprotoné (COO⁻).
• Ils sont solubles dans l'eau en raison de leur caractère ionique.
• Il existe 20 acides aminés naturels qui sont les "briques" des protéines.
• Certains sont synthétisés par l'organisme, d'autres sont essentiels et doivent être apportés par l'alimentation.

Classification des Acides Aminés selon la Polarité de leur Chaîne Latérale (R)

La nature du radical R détermine les propriétés physico-chimiques de l'AA.

• Acides aminés apolaires (hydrophobes) :
  • Glycine (Gly, G)
  • Alanine (Ala, A)
  • Valine (Val, V) - Essentiel
  • Leucine (Leu, L) - Essentiel
  • Isoleucine (Ile, I) - Essentiel
  • Méthionine (Met, M) - Essentiel
  • Proline (Pro, P) - Acide α-iminé, hétérocycle pyrrol
  • Phénylalanine (Phe, F) - Essentiel, aromatique
  • Tryptophane (Trp, W) - Essentiel, aromatique, hétérocyclique

  Ces AA sont solubles dans les solvants organiques.

• Acides aminés polaires non ionisables (hydrophiles) :
  • Sérine (Ser, S)
  • Thréonine (Thr, T) - Essentiel
  • Cystéine (Cys, C) - Soufré
  • Tyrosine (Tyr, Y) - Aromatique
  • Asparagine (Asn, N) - Dérivé amide de l'acide aspartique
  • Glutamine (Gln, Q) - Dérivé amide de l'acide glutamique

  Ces AA peuvent former des liaisons hydrogène avec l'eau.

• Acides aminés polaires ionisables (hydrophiles) :
  • Acides :
    • Acide aspartique (Asp, D)
    • Acide glutamique (Glu, E)
  • Basiques :
    • Lysine (Lys, K) - Essentiel
    • Arginine (Arg, R) - Essentiel (semi-essentiel)
    • Histidine (His, H) - Essentiel (semi-essentiel), hétérocyclique

  Ces AA sont les plus hydrophiles et ne sont pas solubles dans les solvants organiques.

Ionisation des Acides Aminés

• Les AA possèdent au moins deux fonctions ionisables (amine et carboxyle), leur conférant un caractère amphotère.
• Le point isoélectrique (pHi ou pI) est le pH auquel la charge globale de la molécule est nulle. Chaque AA a un pHi spécifique.
  • À pH < pHi : l'AA est sous forme de cation (chargé positivement).
  • À pH = pHi : l'AA est sous forme de zwitterion (charge globale nulle).
  • À pH > pHi : l'AA est sous forme d'anion (chargé négativement).
• Les AA acides (Asp, Glu) ont un pHi proche de 3.
• Les AA basiques (His, Lys, Arg) ont un pHi supérieur à 7.

Absorption des AA Aromatiques

• Les AA aromatiques (Phénylalanine, Tryptophane, Tyrosine) absorbent la lumière ultraviolette entre 260 et 280 nm.
• Cette propriété est utilisée pour déterminer la concentration des protéines en solution par spectrophotométrie UV.

Réactivité Chimique et Rôles Biologiques des Acides Aminés

Les AA sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires grâce à la réactivité de leurs groupes fonctionnels.

• Réactions dues au groupe carboxyle (-COOH) :
  • Décarboxylation : formation d'amines (ex: histidine → histamine, molécule de signalisation).
  • Formation du groupe amide (-CO-NH₂) : ex: glutamate + NH₃ → glutamine.
  • Formation de la liaison peptidique : entre le COOH d'un AA et le NH₂ d'un autre AA, constituant le squelette des protéines.
• Réactions dues au groupe amine (-NH₂) :
  • Désamination : libération d'ammoniac (NH₃), souvent en deux étapes (ex: glutamine → glutamate + NH₃, puis glutamate → α-cétoglutarate + NH₃).
  • Transamination : transfert du groupe NH₂ d'un AA à un α-cétoacide, formant un nouvel AA et un nouveau α-cétoacide (ex: alanine + α-cétoglutarate → pyruvate + glutamate, catalysée par une transaminase avec le phosphate de pyridoxal comme cofacteur).
• Réactions dues à la chaîne latérale (R) :
  • Ces réactions sont à l'origine des modifications post-traductionnelles des protéines.
  • Glycosylation :
    • N-glycosylation sur le NH₂ de l'asparagine (Asn).
    • O-glycosylation sur les OH de la sérine (Ser) et de la thréonine (Thr).
  • Phosphorylation : sur les OH de la sérine (Ser), thréonine (Thr) et tyrosine (Tyr). C'est un mécanisme réversible crucial de régulation des activités enzymatiques.
  • Acétylation : sur les groupes NH₂ de la lysine (Lys).

Les Protéines

Les protéines sont des polymères d'acides aminés liés par des liaisons peptidiques. Elles sont les principales molécules fonctionnelles du vivant.

Liaison Peptidique et Chaîne Polypeptidique

• La liaison peptidique est une liaison amide formée par la condensation du groupe carboxyle d'un AA et du groupe amine d'un autre AA, avec élimination d'une molécule d'eau.
• Elle relie les AA pour former une chaîne polypeptidique.
• Une chaîne polypeptidique possède une extrémité N-terminale (avec un groupe amine libre) et une extrémité C-terminale (avec un groupe carboxyle libre).
• La liaison peptidique est plane et rigide, avec une configuration trans majoritaire (minimisant l'encombrement stérique).
• Les rotations sont possibles autour des liaisons Cα-N (angle Φ) et Cα-C (angle Ψ), déterminant la conformation de la chaîne.

Peptides, Polypeptides et Protéines

• Peptide : courte chaîne d'AA (quelques AA).
• Polypeptide : chaîne plus longue d'AA.
• Protéine : macromolécule fonctionnelle, souvent composée d'une ou plusieurs chaînes polypeptidiques, avec un poids moléculaire élevé (exprimé en Daltons, Da).

Rôles Variés des Protéines

• Catalyse biologique : les enzymes sont des protéines.
• Transport : hémoglobine (O₂), transferrine (Fer).
• Soutien et structure : kératine (cheveux), collagène (tissu conjonctif), fibroïne (soie).
• Contractilité : actine, myosine (muscles).
• Reconnaissance : hormones, récepteurs, anticorps (immunoglobulines).
• Stockage : ovalbumine (blanc d'œuf), caséine (lait), myoglobine (O₂ dans le muscle).
• Régulation : protéines régulatrices de gènes.

Classification des Protéines

• Holoprotéines : composées uniquement d'acides aminés.
• Hétéroprotéines : composées d'une holoprotéine et d'un groupement prosthétique (non protéique) qui confère des propriétés spécifiques.
  • Glycoprotéines (glucides)
  • Lipoprotéines (lipides)
  • Phosphoprotéines (acide phosphorique)
  • Chromoprotéines (pigments, ex: hème dans l'hémoglobine)
  • Nucléoprotéines (acides nucléiques)
  • Métalloprotéines (ions métalliques)
• Protéines fibreuses : rôle structural (kératine, collagène).
• Protéines globulaires : structure compacte, chaînes hydrophobes à l'intérieur, hydrophiles à l'extérieur (majorité des enzymes).
• Protéines membranaires : insolubles dans l'eau, solubilisées par des détergents.

Niveaux de Structure des Protéines

La fonction d'une protéine est intrinsèquement liée à sa structure tridimensionnelle.

1. Structure primaire : Séquence linéaire des acides aminés, déterminée par le code génétique.
2. Structure secondaire : Conformations régulières locales du squelette polypeptidique, stabilisées par des liaisons hydrogène.
   • Hélice α : structure en spirale droite, 3,6 résidus par tour, pas de 5,4 Å. Liaisons hydrogène entre le CO d'un résidu i et le NH d'un résidu i+4. Les chaînes latérales sont orientées vers l'extérieur.
   • Feuillet β : structure étendue où des brins polypeptidiques sont alignés côte à côte, stabilisés par des liaisons hydrogène inter-brins. Peut être parallèle ou antiparallèle.
   • Coudes et boucles : régions non régulières qui connectent les hélices α et les feuillets β, permettant à la chaîne de changer de direction. Souvent impliqués dans les sites actifs et de reconnaissance.
   • Hélice gauche du collagène : structure particulière du tropocollagène (triple hélice droite composée de trois hélices gauches), riche en glycine, proline et hydroxyproline, avec des motifs répétitifs Gly-Pro-X.
3. Structure tertiaire : Repliement tridimensionnel global d'une chaîne polypeptidique, formant une structure compacte. Stabilisée par diverses interactions :
   • Liaisons ioniques (électrostatiques)
   • Liaisons hydrogène
   • Interactions hydrophobes (le plus important, regroupant les résidus apolaires à l'intérieur)
   • Ponts disulfure (liaisons covalentes entre deux cystéines)

   La structure tertiaire peut inclure des domaines, qui sont des unités de repliement fonctionnelles.

4. Structure quaternaire : Association de plusieurs chaînes polypeptidiques (sous-unités) pour former un complexe fonctionnel (oligomère). Stabilisée par des liaisons faibles (ioniques, hydrogène, hydrophobes) et parfois des ponts disulfure inter-chaînes.
   • Exemples : hémoglobine (tétramère α₂β₂), immunoglobulines (IgG).

Stabilité et Flexibilité des Structures Protéiques

• Flexibilité conformationnelle : Les protéines ne sont pas rigides, elles adoptent de nombreuses conformations, essentielles à leur fonction (ex: enzymes allostériques).
• Protéines intrinsèquement désordonnées : Certaines protéines ou domaines n'ont pas de structure secondaire fixe et se structurent lors d'interactions ou modifications post-traductionnelles.
• Dénaturation : Perte de la structure tridimensionnelle fonctionnelle d'une protéine.
  • Réversible : par des agents chaotropiques (urée, chlorure de guanidium) ou réducteurs (β-mercaptoéthanol pour les ponts disulfure).
  • Irréversible : par la chaleur, UV, pH extrêmes, solvants organiques, détergents (SDS).

Détection des Protéines

• Spectrophotométrie UV : grâce à l'absorption des AA aromatiques (260-280 nm).
• Colorants :
  • Directement en solution.
  • Après séparation par électrophorèse sur gel (SDS-PAGE), où les protéines sont dénaturées par le SDS et migrent selon leur taille. Le gel est ensuite coloré (ex: Bleu de Coomassie).
• Anticorps spécifiques :
  • Western blot : détection d'une protéine spécifique après électrophorèse et transfert sur membrane, en utilisant des anticorps primaires et secondaires.
  • ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) : test en solution pour détecter et quantifier des protéines.
  • Immunohistochimie : localisation de protéines dans des tissus ou cellules.
• Techniques de biologie structurale :
  • Cristallographie aux rayons X : détermination de la structure 3D à partir de cristaux.
  • Cryo-microscopie électronique : détermination de la structure 3D à partir d'échantillons vitrifiés.

Exemple d'Hétéroprotéines : Hémoglobine et Myoglobine

Ces deux chromoprotéines sont essentielles au transport et au stockage de l'oxygène.

• Myoglobine (Mg) :
  • Une seule chaîne polypeptidique (apomyoglobine) de 153 AA.
  • Contient un hème (groupement prosthétique) comme site actif, enfoui dans une poche hydrophobe.
  • L'hème contient un atome de fer (Fe²⁺) capable de fixer réversiblement l'O₂.
  • Rôle : stockage de l'O₂ dans les muscles.
  • Forte affinité pour l'O₂ (courbe de saturation hyperbolique).
• Hémoglobine (Hb) :
  • Tétramère (structure quaternaire) composé de quatre sous-unités (2 chaînes α et 2 chaînes β chez l'adulte).
  • Chaque sous-unité contient un hème.
  • Rôle : transport de l'O₂ dans le sang (globules rouges).
  • Protéine allostérique : la fixation d'O₂ sur une sous-unité augmente l'affinité des autres sous-unités pour l'O₂ (phénomène de coopérativité).
  • Affinité pour l'O₂ modulée par des effecteurs allostériques (H⁺, CO₂, 2,3-bisphosphoglycérate), permettant une libération efficace de l'O₂ dans les tissus (effet Bohr).
  • Courbe de saturation sigmoïde.
  • Peut se lier au CO (carboxyhémoglobine, très stable) et au CO₂ (carbhémoglobine).
  • Drépanocytose : maladie génétique due à une mutation ponctuelle sur la chaîne β de l'Hb, entraînant la formation d'Hb S qui polymérise en désoxyHb S, déformant les globules rouges.

Enzymologie

Les enzymes sont des catalyseurs biologiques, majoritairement protéiques, qui accélèrent les réactions chimiques sans modifier leur équilibre.

Définitions Fondamentales

• Enzyme : Protéine catalytique qui accélère une réaction chimique spécifique.
• Substrat (S) : Molécule transformée par l'enzyme.
• Produit (P) : Molécule résultant de la transformation du substrat.
• Les enzymes abaissent l'énergie d'activation de la réaction.
• Elles sont caractérisées par un pouvoir catalytique élevé et une grande spécificité.

Classification des Enzymes (6 Classes)

1. Oxydo-réductases : catalysent les réactions d'oxydoréduction.
2. Transférases : transfèrent un groupe fonctionnel d'une molécule à une autre.
3. Hydrolases : catalysent l'hydrolyse de liaisons.
4. Lyases : catalysent la rupture de liaisons sans hydrolyse ni oxydation, souvent avec formation de doubles liaisons.
5. Isomérases : catalysent l'isomérisation (réarrangement intramoléculaire).
6. Ligases (synthétases) : catalysent la formation de liaisons avec consommation d'ATP.

Exemple : l'anhydrase carbonique (lyase) hydrate le CO₂ en H₂CO₃, un processus très rapide et spécifique.

Régulation des Enzymes

L'activité enzymatique est finement régulée dans la cellule.

• Contrôles cellulaires :
  • Sur la synthèse des enzymes (transcription, traduction).
  • Sur l'activité des enzymes (mécanismes réversibles et irréversibles).
• Mécanismes réversibles :
  • Inhibition par les produits de la réaction.
  • Enzymes allostériques : activation ou inhibition par des effecteurs qui se lient à un site différent du site actif, entraînant un changement de conformation.
  • Modification covalente : phosphorylation (Ser, Thr, Tyr), acétylation (Lys), méthylation (Glu, Asp). Ex: phosphorylation/déphosphorylation par kinases/phosphatases.
• Mécanismes irréversibles :
  • Glycosylation (addition covalente d'un sucre).
  • Coupures hydrolytiques de la chaîne peptidique (ex: activation du chymotrypsinogène en chymotrypsine par protéolyse).

Notion de Site Actif

• Le site actif est la région de l'enzyme où se lie le substrat et où a lieu la catalyse.
• C'est une entité tridimensionnelle formée par le repliement de la chaîne polypeptidique, rapprochant des résidus d'AA non contigus.
• Il est caractérisé par sa complémentarité avec le substrat (modèle clé-serrure de Fischer ou ajustement induit de Koshland).
• Les AA du site actif peuvent être classés en :
  • AA "non collaborateurs" ou indifférents.
  • AA "collaborateurs" ou de conformation (impliqués dans le repliement).
  • AA auxiliaires (ajustement induit).
  • AA de contact (liaison avec le substrat, catalyse).
• Des groupes fonctionnels nucléophiles (OH de Sérine, SH de Cystéine, Imidazole d'Histidine) sont souvent présents dans le site actif.
• Les mutations affectant les résidus catalytiques peuvent altérer la fonction enzymatique.

Cofacteurs et Coenzymes

Certaines enzymes nécessitent des molécules supplémentaires pour être actives.

• Cofacteur : Composé chimique non protéique nécessaire à l'activité enzymatique.
  • Ions inorganiques (cofacteurs minéraux) : Cu²⁺, Fe²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺.
  • Molécules organiques ou métallo-organiques : appelées coenzymes.
• Holoenzyme = Apoenzyme (partie protéique) + Cofacteur(s).
• Coenzymes :
  • Molécules organiques de faible poids moléculaire, souvent dérivées de vitamines.
  • Agissent comme transporteurs transitoires de groupes fonctionnels spécifiques (ex: NAD⁺/NADH pour les H⁺ et e⁻, Coenzyme A pour les groupes acyle, phosphate de pyridoxal pour les groupes amine).
  • Peuvent être des cosubstrats (liés faiblement à l'apoenzyme) ou des groupements prosthétiques (liés fortement, parfois de manière covalente).

Structures et Assemblages Variés des Enzymes

• Enzymes monomériques : une seule chaîne polypeptidique (structure tertiaire).
• Enzymes oligomériques : plusieurs sous-unités (structure quaternaire), souvent allostériques.
• Complexes multienzymatiques : assemblage de plusieurs enzymes catalysant des réactions séquentielles, optimisant le transfert des substrats.
• Isoenzymes : différentes formes moléculaires d'une enzyme ayant la même activité catalytique mais des propriétés différentes (ex: LDH, avec 5 isoenzymes composées de monomères M et H).

Exemple d'Enzyme : La Chymotrypsine

La chymotrypsine est une protéase à sérine digestive.

• Synthétisée sous forme inactive (chymotrypsinogène) dans le pancréas.
• Activée par protéolyse irréversible (coupure par la trypsine puis auto-coupure) pour former l'α-chymotrypsine active.
• Structure tertiaire compacte, composée de 3 segments peptidiques reliés par des ponts disulfure.
• Site actif situé dans une crevasse, contenant un trio catalytique : Aspartate, Histidine, Sérine.
• Spécificité : hydrolyse les liaisons peptidiques après les résidus d'AA aromatiques (Phe, Tyr, Trp) et certains AA apolaires (Leu, Met).

Cinétique des Réactions Enzymatiques

L'étude de la vitesse des réactions enzymatiques permet de comprendre leur mécanisme et leur régulation.

• La vitesse (v) d'une réaction enzymatique est la quantité de produit formé ou de substrat consommé par unité de temps.
• L'activité enzymatique est exprimée en Unités Enzymatiques (UE) ou en activité spécifique (UE/mg de protéine).

Facteurs Influant sur la Vitesse de Réaction

• Concentration en enzyme ([E]) : La vitesse initiale est directement proportionnelle à [E].
• Température : Il existe une température optimale. Au-delà, la dénaturation de l'enzyme réduit l'activité.
• pH : Il existe un pH optimal, car le pH affecte l'état d'ionisation des groupes fonctionnels de l'enzyme et du substrat.
• Concentration en substrat ([S]) :
  • À faible [S], la vitesse est proportionnelle à [S].
  • À forte [S], l'enzyme est saturée, et la vitesse atteint un maximum (Vmax).
  • Le modèle de Michaelis-Menten décrit cette relation par une hyperbole : v = (Vmax * [S]) / (Km + [S]).
  • La constante de Michaelis (Km) est la concentration de substrat pour laquelle la vitesse est la moitié de Vmax. C'est une mesure inverse de l'affinité de l'enzyme pour son substrat.
  • La représentation de Lineweaver et Burk (double inverse) permet de linéariser cette relation et de déterminer Vmax et Km.
• Inhibiteurs : Molécules qui réduisent l'activité enzymatique.
  • Non spécifiques : agissent sur des groupes fonctionnels communs à plusieurs enzymes (ex: acide monoiodoacétique sur SH, DIFP sur OH de sérine).
  • Spécifiques : agissent sur une enzyme particulière.
    • Irréversibles : se lient de manière covalente ou très stable au site actif (ex: aspirine sur la cyclooxygénase).
    • Réversibles :
      • Compétitifs : l'inhibiteur (I) ressemble au substrat (S) et se lie au site actif, augmentant le Km apparent (diminution de l'affinité) sans modifier Vmax.
      • Non compétitifs : l'inhibiteur se lie à un site différent du site actif, diminuant Vmax sans modifier Km (diminution de l'activité catalytique).
• Effecteurs allostériques : Modulent l'activité des enzymes allostériques en se liant à un site régulateur.
  • Activateurs allostériques : augmentent l'affinité (diminuent Km) ou la vitesse (augmentent Vmax).
  • Inhibiteurs allostériques : diminuent l'affinité (augmentent Km) ou la vitesse (diminuent Vmax).
  • Les courbes de cinétique allostérique sont sigmoïdes.

Spécificité de l'Action Enzymatique

• Spécificité liée à la réaction : Chaque enzyme catalyse un type de réaction spécifique (ex: oxydase, décarboxylase).
• Spécificité liée au substrat :
  • Large : l'enzyme agit sur plusieurs substrats similaires (ex: hexokinase sur différents hexoses).
  • Étroite : l'enzyme agit sur un seul substrat (ex: glucokinase sur le glucose).
• Exemple des peptidases (hydrolases) :
  • Exopeptidases : coupent les AA aux extrémités de la chaîne (aminopeptidases, carboxypeptidases).
  • Endopeptidases : coupent les liaisons peptidiques à l'intérieur de la chaîne (pepsine, trypsine, chymotrypsine, élastase), avec des spécificités différentes selon les AA adjacents à la liaison coupée.