Frottis sanguin et formule leucocytaire

TD, chapitre 4 : Frottis sanguin et formule leucocytaire

Ce chapitre aborde les principes du frottis sanguin et de la formule leucocytaire, l'identification des cellules sanguines physiologiques et l'interprétation des résultats.

I- Le frottis sanguin

Le frottis sanguin est une technique qui permet d'obtenir sur une lame de verre une couche unicellulaire d'éléments figurés du sang, répartis de manière homogène et fixés dans un état proche de leur état physiologique.

II- La coloration MGG (May-Grünwald Giemsa)

La coloration MGG repose sur l'action complémentaire de deux colorants neutres et sur l'affinité des éléments cellulaires pour des colorants acides ou basiques (affinité tinctoriale).

• Le May-Grünwald (neutre) est composé d'éosine (acide) et de bleu de méthylène (basique).

• Le Giemsa (neutre) est composé d'éosine (acide) et d'azurs de méthylène (basique).

• Ces sels sont en solution dans du méthanol et n'ont pas de pouvoir colorant tant qu'ils ne sont pas dissociés.

• L'addition d'eau neutre (pH=7) provoque la dissociation des sels et l'activation de leur pouvoir colorant.

Les affinités tinctoriales sont les suivantes :

• Acidophile : du gris au légèrement rosé.

• Neutrophile : rose-violet.

• Basophile : violet foncé au noir.

• Azurophile : rose-rouge.

Un colorant basique (bleu de méthylène) va attirer un élément acide (ADN), le rendant basophile. L'hémoglobine, étant basique, sera acidophile.

III- Analyse morphologique des cellules sanguines

A- Zone d'observation

Il est crucial d'observer le frottis dans une zone où les cellules sont bien étalées, non superposées et intactes pour une analyse morphologique précise.

B- Les érythrocytes (Globules Rouges)

Les érythrocytes physiologiques doivent présenter une taille, une forme, une couleur et un cytoplasme constants, sans regroupement anormal.

• Un globule rouge qui n'a pas beaucoup de couleur est dit hypochrome.

C- Les thrombocytes (Plaquettes)

• Forme irrégulière.

• Absence de noyau.

• Nombreuses granulations azurophiles, claires et fines.

À observer :

• Leur taille (normalement 2 à 4 µm) : présence de plaquettes géantes ?

• Leur nombre moyen par champ (environ 5 à 10 par champ à l'objectif x100).

• Leur mode de regroupement (isolées ou en amas).

D- Les leucocytes (Globules Blancs)

Pour reconnaître les leucocytes au MGG, il faut observer :

• La taille de la cellule.

• Le rapport nucléo-cytoplasmique (N/C).

• La coloration du noyau (densité de la chromatine).

• La forme du noyau.

• Le nombre de lobes nucléaires.

• La coloration du cytoplasme.

• La présence de granulations (taille, densité, coloration).

Les polynucléaires (granulocytes)

En général, les polynucléaires ont une taille entre 10 et 17 µm, une forme arrondie, une chromatine dense et une affinité acidophile claire (gris-rose).

• Polynucléaire neutrophile (PN) :

  • Noyau : 2 à 5 lobes.

  • Granulations : irrégulières, fines, nombreuses, dispersées et neutrophiles (rose/violet).

• Polynucléaire basophile (PB) :

  • Noyau : deux ou trois lobes.

  • Granulations : grosses, recouvrant le noyau et le cytoplasme, basophiles (violet-noir).

• Polynucléaire éosinophile (PE) :

  • Noyau : 2 ou 3 lobes.

  • Granulations : nombreuses, concentrées au centre, éosinophiles (rouge-orangé).

Les monocytes (Mn)

• Taille : 16 à 20 µm.

• Forme : arrondie mais déformable.

• Noyau : variable, souvent encoché (en U), chromatine légère et filamenteuse.

• Cytoplasme : affinité basophile claire (gris/bleu).

• Granulations : azurophiles indiscernables mais nombreuses, donnant un aspect de cytoplasme "gris sale".

Les lymphocytes (Ly)

• Petit lymphocyte :

  • Taille : 7 à 9 µm, arrondie.

  • Cytoplasme : affinité basophile claire (gris/bleu), pas de granulations, couronne périnucléaire mince.

  • Noyau : rond, chromatine très dense, occupe presque toute la cellule.

• Grand lymphocyte :

  • Taille : 10 à 15 µm.

  • Forme : arrondie mais déformable (côté plat).

  • Noyau : rond, chromatine dense et lisse, mottée.

  • Cytoplasme : affinité basophile claire (gris/bleu), presque transparente, pas de granulations.

Le plasmocyte

• Taille : 12 à 15 µm.

• Forme : ovale, fuselée.

• Noyau : rond, excentré, chromatine dense.

• Cytoplasme : affinité basophile (riche en ARN, bleu/violet), sans granulations.

IV- Établissement de la formule leucocytaire

A- Réalisation de la formule leucocytaire

La formule leucocytaire est réalisée sur le frottis sanguin coloré au MGG.

• La qualité du frottis doit être vérifiée à faible grossissement : les leucocytes doivent être intacts et leur répartition homogène.

• Lecture de 100 à 200 éléments en "créneaux" (méthode de balayage systématique).

• Noter le nombre de chaque type de leucocyte observé.

• Le résultat est obtenu en pourcentage.

L'interprétation des résultats se fait en valeurs absolues, en utilisant le nombre total de leucocytes.

Exemple de calcul : Si 60 PN sont observés sur 100 leucocytes et que le nombre total de leucocytes est de 7x10³ leucocytes/L, alors le nombre absolu de PN est de (60/100) * 7x10³ = 4.2x10³ PN/L.

B- Interprétations de la formule leucocytaire

Les valeurs de référence varient selon l'âge (nourrisson vs adulte) et le sexe (femme vs homme pour certaines déterminations).

Interprétations des variations :

• PN < valeurs physiologiques : neutropénie.

• PN > valeurs physiologiques : hyperneutrophilie (souvent lié à des infections/inflammations).

• PE > valeurs physiologiques : hypéréosinophilie (souvent lié à des allergies ou infections parasitaires).

• PB > valeurs physiologiques : hyperbasocytose (rare, peut être lié à des cancers).

• Lymphocytes < valeurs physiologiques : lymphopénie.

• Lymphocytes > valeurs physiologiques : hyperlymphocytose (souvent lié à des infections virales ou cancers).

• Monocytes < valeurs physiologiques : monocytopénie.

• Monocytes > valeurs physiologiques : hypermonocytose (souvent lié à des infections chroniques ou cancers).

Ces variations peuvent indiquer des problèmes d'hématopoïèse, des infections, des inflammations, des allergies ou des cancers.

Cours, chapitre 3 : Hémogramme

L'hémogramme, ou Numération Formule Sanguine (NFS), est un ensemble d'examens élémentaires indispensables au diagnostic hématologique, comprenant une analyse quantitative et qualitative des éléments figurés du sang.

I- Définitions

L'hémogramme est un examen quantitatif des cellules sanguines (hématies, leucocytes, plaquettes), de l'hémoglobine et des indices érythrocytaires. Il est complété par un examen qualitatif via le frottis sanguin coloré au microscope.

Les phases d'une analyse en laboratoire de biologie médicale sont :

• Phase pré-analytique : processus avant l'analyse (prélèvement, acheminement, stockage).

• Phase analytique : l'analyse elle-même.

• Phase post-analytique : étapes après l'analyse (transcription, validation, transmission des résultats).

II- Prélèvements et préparations sanguins

Le prélèvement sanguin peut être veineux (pli du coude chez l'adulte) ou capillaire (talon chez les bébés), pour obtenir un volume suffisant. Il peut être recueilli avec ou sans anticoagulant.

Les 3 grandes classes d'anticoagulants sont :

III- Numération manuelle des éléments figurés du sang

Systèmes de dilution

• Hématies : dilution isotonique (1/200) pour préserver leur intégrité.

• Leucocytes : dilution hypotonique (1/20) pour lyser les hématies et faciliter le dénombrement des leucocytes.

• Plaquettes : dilution hypotonique (1/100) pour éviter l'agrégation et préserver les plaquettes.

Les hématimètres

Les hématimètres (par exemple, cellule de Malassez ou de Thoma) sont des chambres de comptage utilisées pour la numération manuelle des cellules sanguines.

• Volume d'un grand rectangle (chambre de Malassez) : 2,5 x 2 x 0,2 = 1 mm³.

• Volume d'un moyen rectangle (chambre de Malassez) : 0,25 x 0,20 x 0,20 = 0,01 mm³.

• Volume d'un grand carré (chambre de Thoma) : 1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm³.

• Volume d'un carré moyen (chambre de Thoma) : 0,20 x 0,20 x 0,10 = 0,004 mm³ (ou 0,004 µL).

La formule générale pour calculer la concentration est :

N (nb. de cellules/L de sang) = X × d × 10⁶ / (Vc × Nb.c)

• X : nombre de cellules comptées.

• d : facteur de dilution.

• Vc : volume d'une chambre de comptage.

• Nb.c : nombre de chambres comptées.

Exemple de calcul de concentration en érythrocytes comptés sur Thoma :

Si X = 1000 GR sur 10 carrés moyens, d = 200, Vc = 0,004 mm³, Nb.c = 10 carrés moyens.

N = 1000 × 200 × 10⁶ / (0,004 × 10) = 5 × 10¹² GR/L de sang.

Valeurs physiologiques et pathologiques

Interprétations des variations :

• Érythropénie : GR < valeurs physiologiques.

• Polyglobulie : GR > valeurs physiologiques.

• Leucopénie : GB < valeurs physiologiques.

• Hyperleucocytose : GB > valeurs physiologiques.

• Thrombopénie : Plaquettes < valeurs physiologiques.

• Hyperthrombocytose : Plaquettes > valeurs physiologiques.

• Pancytopénie : Les trois lignées (GR, GB, Plaquettes) sont en dessous des valeurs physiologiques.

IV- Étude des érythrocytes et indices érythrocytaires

A- Dosage de l'hémoglobine (Hb)

L'hémoglobine est la protéine des globules rouges responsable du transport de l'oxygène.

Interprétations des variations :

• Anémie : Hb < valeurs physiologiques.

• Polyglobulie : Hb > valeurs physiologiques.

B- Détermination de l'hématocrite (Ht)

L'hématocrite est la fraction du volume sanguin occupée par les hématies après sédimentation ou centrifugation. C'est le rapport du volume des hématies sur le volume de sang total.

Un volume globulaire augmenté ou diminué peut être observé.

C- Calcul des indices érythrocytaires

Ces trois indices donnent une idée de l'état des globules rouges et sont essentiels pour caractériser une anémie.

• Volume Globulaire Moyen (VGM) :

  • VGM = (Ht / GR) × 10

  • Valeur normale : 82-98 fL.

  • Microcytaire : VGM < 80 fL.

  • Normocytaire : VGM entre 80 et 100 fL.

  • Macrocytaire : VGM > 100 fL.

• Teneur Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine (TCMH) :

  • TCMH = (Hb / GR) × 10

  • Valeur normale : 27-32 pg.

• Concentration Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine (CCMH) :

  • CCMH = (Hb / Ht) × 100

  • Valeur normale : 32-36 g/dL.

  • Hypochrome : CCMH < 32 g/dL.

  • Normochrome : CCMH entre 32 et 36 g/dL.

Il est crucial d'interpréter ces indices pour conclure sur la présence et le type d'anémie :

• Normocytaire/Normochrome : VGM et CCMH normaux.

• Microcytaire/Hypochrome : VGM et CCMH diminués (ex : anémie ferriprive).

• Macrocytaire : VGM augmenté (ex : anémie mégaloblastique).

Cours, chapitre 1 : Le tissu sanguin

Ce chapitre présente les définitions principales du sang et de ses constituants, les caractéristiques et fonctions des cellules sanguines, ainsi que les notions fondamentales de l'hématologie.

I- Sang, plasma et sérum : définitions

A- Le sang

Le sang est un tissu fluide circulant dans le système vasculaire, composé d'une suspension de cellules dans le plasma.

Sang = plasma + cellules sanguines

• Volume total : 5 à 6 litres (environ 8% de la masse corporelle).

• Composition : 55% de plasma et 45% de cellules.

Fonctions principales du sang :

• Transport de gaz (O₂, CO₂).

• Transport de nutriments.

• Transport de déchets métaboliques.

• Communication/transport d'hormones.

• Régulation thermique.

• Pouvoir tampon (régulation du pH).

• Défense immunitaire.

• Répartition des lipides.

• Coagulation.

B- Le plasma

Le plasma est la partie liquide du sang, obtenue après centrifugation d'un sang recueilli sur anticoagulant. Il est dépourvu de cellules sanguines (globules rouges, globules blancs, plaquettes).

Après centrifugation, on observe trois phases :

• Le plasma (liquide supérieur).

• La couche leucocytaire (couche mince de globules blancs et plaquettes).

• Les globules rouges (au fond du tube).

C- Le sérum

Le sérum est obtenu après coagulation du sang. Il s'agit du plasma duquel les facteurs de coagulation ont été consommés et sont donc absents.

Pour l'obtenir :

• Le sang total est recueilli dans un tube sec (sans anticoagulant).

• La coagulation se produit, consommant les facteurs de coagulation.

• Après centrifugation ou sédimentation, on obtient le sérum (liquide supérieur) et un caillot contenant les globules rouges et les facteurs de coagulation.

II- Les cellules sanguines

Les cellules sanguines sont divisées en trois catégories principales : les érythrocytes, les thrombocytes et les leucocytes.

A- Les érythrocytes (Globules Rouges ou Hématies)

• Diamètre : 7,5 µm.

• Épaisseur : 2,5 µm.

• Forme : biconcave, ce qui leur permet de passer dans les capillaires.

• Absence d'organites et d'acides nucléiques (pas d'ADN).

• Très déformables.

• Durée de vie : 120 jours.

• Fonction principale : Transport et maintien de l'hémoglobine à l'état fonctionnel pour le transport gazeux (O₂ et CO₂).

B- Les thrombocytes (Plaquettes)

• Diamètre : 2-4 µm.

• Forme : discoïde, anucléée.

• Durée de vie : 7-10 jours.

• Rôles majeurs :

  • Hémostase primaire (formation du clou plaquettaire).

  • Protection des endothéliums vasculaires.

  • Implication dans l'inflammation.

C- Les leucocytes (Globules Blancs)

Les leucocytes sont classés en deux grandes catégories : les cellules mononucléées (monocytes et lymphocytes) et les granulocytes (polynucléaires).

• Les cellules mononucléées possèdent un noyau unique (non lobé).

• Les polynucléaires possèdent un noyau lobé (plusieurs lobes).

1- Les polynucléaires (granulocytes)

• Polynucléaires neutrophiles :

  • Rôle : Défense immunitaire non spécifique (phagocytose et action bactéricide) et inflammation.

  • Passent dans les tissus en 12 heures.

  • Durée de vie : quelques jours.

• Polynucléaires éosinophiles :

  • Rôle : Modulateurs de l'allergie et défense anti-parasitaire.

  • Passent dans les tissus en 6-8 heures.

  • Durée de vie : 8 à 10 jours.

• Polynucléaires basophiles :

  • Rôle : Majeur dans l'allergie (hypersensibilité immédiate) en libérant le contenu de leurs granules (histamine).

  • Passent dans les tissus en cas d'allergie.

  • Durée de vie : 3 à 4 jours dans le sang.

2- Les monocytes

• Diamètre : 16-20 µm.

• Forme : arrondie.

• Noyau : en forme de U (un seul lobe).

• Durée de vie : 2 à 3 jours dans le sang.

• Passent dans les tissus pour devenir des macrophages (vivent plusieurs mois) ou des cellules dendritiques.

• Rôle : Présentation d'antigènes (Ag).

3- Les lymphocytes

• Diamètre : 7 à 15 µm.

• Forme : ronde.

• Noyau : un seul lobe rond.

• Durée de vie : variable (quelques jours à plusieurs années).

• Rôle majeur dans l'immunité spécifique (humorale et cellulaire).

• Il existe différents types de lymphocytes (T, B, NK) avec des fonctions variées.

• Les lymphocytes B peuvent se différencier en plasmocytes pour l'excrétion d'anticorps.

Cours, chapitre 2 : Production des cellules sanguines : Hématopoïèse

Ce chapitre explore le processus physiologique de l'hématopoïèse, assurant la synthèse et le remplacement continu et régulé des cellules sanguines matures, ainsi que les lieux et mécanismes de cette production.

I- Introduction et définitions

L'hématopoïèse est le processus physiologique qui assure la synthèse et le remplacement continu et régulé des cellules sanguines matures.

• Production quotidienne : 200 milliards de globules rouges, 100 milliards de plaquettes, 3 milliards de polynucléaires.

• La quantité de cellules sanguines reste constante grâce à la capacité de renouvellement assurée par les cellules souches hématopoïétiques (CSH).

II- Les cellules de l'hématopoïèse

A- Les cellules souches

Les cellules souches sont classées selon leur potentiel de différenciation :

• Cellules souches totipotentes : Capables de former un organisme entier (ex: zygote).

• Cellules souches pluripotentes : Peuvent donner n'importe quel type de cellule mais pas un organisme entier (ex: cellules souches embryonnaires).

• Cellules souches multipotentes : Peuvent donner plusieurs types de cellules appartenant à une même lignée ou à un même organe (ex: CSH).

• Cellules souches unipotentes : Ne peuvent donner qu'un seul type de cellule (ex: progéniteurs spécifiques).

B- Les cellules souches hématopoïétiques (CSH)

Les CSH possèdent des caractéristiques essentielles :

• Auto-renouvellement : Assurent la production du stock de CSH.

• Indifférenciées morphologiquement : Ne peuvent être distinguées par leur morphologie seule.

• Marqueur CD34+ : Molécule de surface caractéristique.

• Majoritairement en phase G0 : Se divisent peu, mais peuvent être activées.

• Multipotence : Représentent environ 0,01% des cellules de la moelle osseuse.

• Différenciation : Se situent dans les niches de la moelle osseuse et peuvent passer dans la circulation sanguine.

C- Toutes les cellules hématopoïétiques

La différenciation des CSH suit une hiérarchie :

• Progéniteur (CFU = Colony Forming Unit) : Cellule plus engagée, pouvant encore donner différents types cellulaires, mais ayant perdu la capacité d'auto-renouvellement.

• Précurseur : Cellule engagée, ne pouvant donner qu'un seul type cellulaire, mais non totalement différenciée.

• Cellule mature : Cellule totalement différenciée (ex: cellule sanguine).

III- Lieux de l'hématopoïèse

A- Sièges de l'hématopoïèse au cours de la vie

L'hématopoïèse se déroule dans différents organes selon le stade de développement :

• Embryon : Sac vitellin.

• Fœtus : Foie (principal), rate, puis moelle osseuse.

• Adulte : Moelle osseuse (principalement).

B- Sièges de l'hématopoïèse chez l'adulte

Chez l'adulte, l'hématopoïèse active se situe principalement dans la moelle osseuse rouge des os plats (sternum, crâne, vertèbres, os iliaques) et des épiphyses des os longs.

C- La moelle osseuse

La moelle osseuse est un tissu conjonctif spécialisé dans la production des cellules sanguines, situé dans les cavités des os.

• Moelle osseuse rouge : Active hématologiquement, fabrique les cellules sanguines.

• Moelle osseuse graisseuse (jaune) : Riche en graisse, remplace progressivement la moelle rouge avec l'âge, notamment dans la diaphyse des os longs.

La moelle osseuse est composée de quatre compartiments :

• Cadre osseux : Travées osseuses servant de support.

• Compartiment vasculaire : Vaisseaux sanguins (sinusoïdes) et hormones.

• Microenvironnement ou stroma : Matrice extracellulaire et fibroblastes, fournissant un soutien et des facteurs de croissance.

• Parenchyme hématopoïétique : Contient les CSH, progéniteurs, précurseurs et cellules matures en développement.

IV- Mécanismes cellulaires de l'hématopoïèse

A- L'érythropoïèse

L'érythropoïèse est le processus de production des globules rouges, qui dure environ 7 jours.

Les étapes de maturation (à savoir reconnaître) :

1. Proérythroblaste : Grande cellule indifférenciée, sensible à l'érythropoïétine (EPO).

2. Érythroblaste basophile : Diminution de la taille, noyau plus petit, cytoplasme basophile (riche en ARN).

3. Érythroblaste polychromatophile : Synthèse d'hémoglobine, le cytoplasme devient polychromatophile (mélange de basophilie et d'acidophilie).

4. Érythroblaste acidophile (ou oxyphile) : Cytoplasme acidophile (riche en hémoglobine), noyau picnotique.

5. Réticulocyte : Éjection du noyau, présence de résidus d'ARN.

6. Globule rouge mature : Cellule anucléée, biconcave.

Observations clés :

• Diminution progressive de la taille de la cellule et du noyau.

• Diminution du rapport nucléo-cytoplasmique (N/C).

• Diminution de la basophilie du cytoplasme (due au remplacement de l'ARN par l'hémoglobine).

Régulation principale : L'érythropoïétine (EPO), produite par le cortex rénal, est le signal qui stimule la moelle osseuse à produire plus de globules rouges en cas de manque d'oxygène.

B- La mégacaryopoïèse

La mégacaryopoïèse est le processus de production des plaquettes, qui dure environ 8 jours.

Étapes clés :

• Mégacaryoblaste.

• Promégacaryocyte.

• Mégacaryocyte :

  • Mode de division unique : l'endomitose (caryocinèse sans cytocinèse), entraînant une polyploïdie du noyau (de 2N à 64N).

  • Augmentation de la taille de la cellule.

  • Augmentation de la segmentation du noyau.

  • Apparition de granulations.

  • Libération de plaquettes par fragmentation du cytoplasme (un mégacaryocyte peut produire 2000 à 5000 plaquettes).

Régulation principale : La thrombopoïétine, produite par le foie et les reins.

C- La granulopoïèse

La granulopoïèse est le processus de production des granulocytes (polynucléaires neutrophiles, éosinophiles, basophiles), qui dure environ 4 à 5 jours.

Étapes clés :

1. Myéloblaste.

2. Promyélocyte : Formation des granulations primaires (azurophiles).

3. Myélocyte : Apparition des granulations secondaires (spécifiques : neutrophiles, basophiles, éosinophiles).

4. Métamyélocyte : Noyau encoché, début de la lobulation.

5. Polynucléaire en bande : Noyau en forme de fer à cheval.

6. Polynucléaire mature : Noyau lobé.

Régulation principale : Le G-CSF (Granulocyte-Colony Stimulating Factor).

D- La monocytopoïèse

La monocytopoïèse est le processus de production des monocytes, qui dure environ 48 heures.

Étapes clés :

• Monoblaste.

• Promonocyte : Apparition de grains azurophiles, augmentation de la taille de la cellule.

• Monocyte mature : Noyau massif, aspect irrégulier, taille de la cellule diminue légèrement.

Régulation principale : Le M-CSF (Monocyte-Colony Stimulating Factor).

E- La lymphopoïèse

La lymphopoïèse est le processus de production des lymphocytes, qui dure quelques jours à quelques semaines.

• Différence de lieu de maturation entre les lymphocytes T (thymus) et les lymphocytes B (moelle osseuse).

• Lymphopoïèse primaire : Production des lymphocytes naïfs dans les organes lymphoïdes centraux (moelle osseuse, thymus).

• Lymphopoïèse secondaire : Activation du système immunitaire dans les organes lymphoïdes périphériques, menant à la différenciation en lymphocytes T activés (helper ou cytotoxiques) ou en plasmocytes (pour les lymphocytes B).