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I. Introduction : Définitions et Propriétés Générales des Protéines

Les protéines, du grec proto signifiant « premier », sont des macromolécules essentielles à la vie, présentes dans tous les organismes vivants et participant à toutes les fonctions biologiques. Leur diversité fonctionnelle découle de la diversité de leurs structures tridimensionnelles, qui se construisent à partir d'environ 20 monomères différents.

Les Protéines : Polymères d'Acides α-Aminés

• Dans le vivant, environ 500 acides aminés (AA) ont été identifiés, mais seulement 20 sont dits protéinogènes.

• Ces acides α-aminés protéinogènes sont impliqués dans la synthèse, la dégradation et la transformation (métabolisme des acides aminés).

• Les protéines sont synthétisées par traduction et dégradées par protéolyse (métabolisme des protéines).

• L'union de deux acides aminés par une liaison peptidique forme un dipeptide, trois AA un tripeptide.

• Un oligopeptide contient moins de 10 AA.

• Un polypeptide contient moins de 100 AA.

• Une protéine contient plus de 100 AA.

• La titine (ou connectine) est la plus grande protéine humaine, avec 35 000 AA.

Les Protéines : Diversité Structurale

Les protéines présentent 5 niveaux d'organisation structurale :

1. Structure primaire

2. Structure secondaire

3. Structure tertiaire

4. Structure quaternaire

5. Complexe multimérique

Elles adoptent deux formes tridimensionnelles principales :

• Globulaire

• Fibreuse (ou fibrillaire)

On distingue également :

• Les holoprotéines : composées uniquement d'acides aminés.

• Les hétéroprotéines : comprenant des molécules non protéiques (groupements prosthétiques).

Les Protéines : Diversité des Fonctions

Les protéines remplissent des fonctions très diverses au sein de la cellule et de l'organisme. Un moyen mnémotechnique pour les retenir est "PRÊNES" :

• Protection

• Régulation

• mOuvement

• Transport

• Énergie

• influx Nerveux

• Enzymes

• Structure

Les Protéines : Diversité des Méthodes d'Études

Les protéines peuvent être étudiées par diverses méthodes :

• Chimiques

• Physiques

• Séparatives

• D'immuno-dosages

• De spectrométrie de masse

• Avec des capteurs spécifiques

• Bioinformatiques

II. Acides Aminés : Structures et Propriétés Physico-Chimiques

Les Acides Aminés : Généralités

• Un acide aminé est une molécule bifonctionnelle possédant une fonction amine et une fonction acide carboxylique.

• Il possède également une chaîne latérale (résidu ou R) qui varie et différencie les acides aminés entre eux.

• La fonction amine est portée par le carbone α des acides α-aminés, le carbone β des acides β-aminés, ou le carbone γ des acides γ-aminés.

• Le rôle principal des AA est d'entrer dans la composition des protéines. Les AA qui composent les protéines sont tous des acides α-aminés protéinogènes.

• Cependant, certains acides α-aminés protéinogènes, non protéinogènes, β-aminés et γ-aminés ont d'autres fonctions.

Exemples :

• Glutamate : acide α-aminé protéinogène et neurotransmetteur.

• Citrulline : acide α-aminé non protéinogène, intermédiaire du métabolisme de l'urée.

• β-alanine : acide β-aminé, composant du co-enzyme A.

• Acide γ-aminobutyrique (GABA) : acide γ-aminé, neurotransmetteur.

Focus : La pastèque et la L-citrulline

La L-citrulline, un acide α-aminé non protéinogène, est un intermédiaire du cycle de l'urée. Elle a des effets bénéfiques sur la fonction vasculaire et l'augmentation de la masse musculaire. Les cucurbitacées, notamment la pastèque, sont une source naturelle de L-citrulline.

Les Acides α-Aminés : Structure

• Nomenclature : nom complet (ex: glycine), code à 3 lettres (ex: Gly), code à 1 lettre capitale (ex: G).

• Possèdent un carbone α asymétrique (molécule chirale, sauf la glycine).

• Possèdent un groupe acide carboxylique (–COOH), un groupe amine (–NH2) et une chaîne latérale (R) sur le carbone α.

• Le groupe R varie et confère une diversité de polarité, d'hydrophobie, d'hydrophilie, de charge, de taille et de réactivité chimique.

• 9 acides aminés sont indispensables à l'Homme (non biosynthétisables ou en quantités insuffisantes) : Méthionine, Leucine, Valine, Lysine, Isoleucine, Phénylalanine, Tryptophane, Histidine, Thréonine, Arginine (nécessaire dans certaines périodes ou pathologies). Ils doivent être apportés par l'alimentation.

Définition : Polarité

Caractérise une molécule ou un groupe d'atomes selon la répartition des électrons (charges). Une répartition asymétrique rend la molécule polaire, une répartition symétrique la rend apolaire.

Définition : Hydrophilie et Hydrophobie

Dépend de la polarité. Une molécule polaire est hydrophile (soluble dans l'eau), une molécule apolaire est hydrophobe (insoluble dans l'eau, soluble dans les solvants apolaires).

Les Acides α-Aminés : Propriétés Physico-Chimiques

Selon la polarité et l'état d'ionisation de la chaîne latérale à pH 7, les 20 acides α-aminés protéinogènes sont répartis en 3 classes :

• Les α-AA apolaires (ou non polaires) : 9 AA (7 aliphatiques, 2 aromatiques), chaîne latérale apolaire, hydrophobes.

• Les α-AA polaires neutres : 6 AA (3 à fonctions alcool, 1 soufré, 2 amides), chaîne latérale polaire et non ionisée à pH 7, hydrophiles.

• Les α-AA polaires ionisables : 5 AA (2 acides chargés négativement, 3 basiques chargés positivement), chaîne latérale polaire et ionisée à pH 7, hydrophiles.

Tous les AA possèdent au moins 2 groupements ionisables : acide carboxylique (acide faible) et amine (base faible), ce qui les rend amphotères.

Définition : Amphotère

Du grec amphi (« les deux »). Une molécule qui se comporte comme un acide (donneur de protons) et comme une base (accepteur de protons) en solution.

Chaque AA est caractérisé par le pK (ou pKa) de ses fonctions ionisables et son pI (ou pHi).

Définition : pK (ou pKa)

pH de demi-dissociation d'une fonction ionisable, c'est-à-dire le pH auquel une fonction ionisable existe à 50% sous sa forme protonée et à 50% sous sa forme déprotonée.

• Tous les AA ont un pK₁ (fonction carboxyle, entre 1,8 et 2,8) et un pK₂ (fonction amine, entre 8,8 et 10,6).

• Seuls 7 AA ont une chaîne latérale ionisable caractérisée par un pKᵣ ou pK₃.

Le pI (ou pHi) dépend des pK de ses fonctions ionisables et s'obtient en calculant la moyenne de deux pK :

• Pour un AA à R non ionisable :

• Pour un AA à R ionisable chargé négativement à pH₁ :

• Pour un AA à R ionisable chargé positivement à pH₁ :

Dans le cas d'un AA à chaîne latérale non ionisable (ex: alanine), il existe 3 états d'ionisation en équilibre :

• À faible pH : carboxyle et amine protonés, l'AA est un cation (+1).

• Lorsque le pH augmente : l'AA est un zwitterion (charge nulle, pI).

• Lorsque le pH augmente encore : les deux fonctions sont déprotonées, l'AA est un anion (-1).

La Liaison Peptidique

• Liaison entre –COOH et –NH₂. C'est une liaison amide dite peptidique.

• La nomenclature se fait de l'extrémité N-terminale (gauche) à l'extrémité C-terminale (droite).

• La liaison peptidique s'établit par élimination d'une molécule d'eau entre le groupement –COOH d'un AA et le groupement –NH₂ de l'AA suivant.

• La liaison peptidique est plane et rigide (pas de rotation autour de la liaison C-N en raison de son caractère de double liaison partielle).

• Elle est polaire (l'oxygène a une charge négative partielle supérieure à celle de l'azote). Le groupe NH est un donneur d'hydrogène, le groupe CO est un accepteur d'hydrogène.

• Ces liaisons hydrogène stabilisent les structures secondaires des protéines.

• La liaison peptidique peut exister sous forme d'isomères cis et trans. L'isomère trans est majoritaire dans les protéines, sauf pour la proline où les deux isomères sont comparables en stabilité.

III. Protéines : Structures et Propriétés Physico-Chimiques

Les Niveaux d'Organisation des Protéines

Les protéines ont 5 niveaux d'organisation structurale :

1. Structure primaire

2. Structure secondaire

3. Structure tertiaire

4. Structure quaternaire

5. Complexe multimérique

Structure Primaire

• Correspond à la séquence des acides α-aminés, du premier (N-terminal) au dernier (C-terminal).

• La séquence est écrite de gauche à droite (N-ter vers C-ter) en utilisant le code à une ou trois lettres.

Structure Secondaire

• Contrairement à la liaison peptidique rigide, les liaisons simples NH–Cα (angle φ) et Cα–CO (angle ψ) peuvent tourner.

• Les angles φ et ψ définissent la conformation locale de la chaîne protéique et sont représentés sur le diagramme de Ramachandran.

• Certaines associations d'angles sont impossibles (encombrement stérique), d'autres conduisent à des structures stables comme les feuillets β et les hélices α.

• Ces structures sont dites régulières (ou périodiques) car les angles φ et ψ se répètent.

• Les structures régulières sont connectées par des structures non régulières (non périodiques) : boucles et coudes.

• La séquence des AA influence la formation des éléments de structure secondaire (ex: glutamate et méthionine pour les hélices, valine et isoleucine pour les feuillets, glycine et proline pour les coudes).

Hélices α et autres structures hélicoïdales

• Enroulements réguliers de fragments de chaînes polypeptidiques.

• L'hélice α (ou hélice 3,6) est la principale hélice droite rencontrée.

• D'autres hélices existent, comme l'hélice α gauche.

• Des structures en triple hélice composent les collagènes (protéines fibreuses), avec un motif –Glycine–X–Y– (X souvent proline, Y souvent 4-hydroxyproline).

Brins β et feuillets β plissés

• Un brin β est un fragment de chaîne polypeptidique en conformation étirée.

• Un brin β isolé est instable ; il s'associe à d'autres brins pour former un feuillet β plissé, stabilisé par des liaisons hydrogène entre les groupes NH et CO des liaisons peptidiques de brins voisins.

• Trois catégories de feuillets β plissés existent selon l'orientation des brins : parallèles, antiparallèles, mixtes.

Boucles et coudes

• Connectent les hélices α et les feuillets β.

• Permettent des changements d'orientation de la chaîne polypeptidique.

• Les coudes contiennent peu de résidus (moins de 5), les boucles en contiennent davantage (jusqu'à plus de 20).

• Les principaux coudes sont le coude γ (3 résidus) et le coude β (4 résidus), connectant souvent deux brins β antiparallèles.

Structure Tertiaire

• Structure globale résultant du repliement de la protéine.

• Implique des interactions entre éléments de structure secondaire par des liaisons faibles (non covalentes) :

  • Liaisons hydrogène

  • Liaisons ioniques

  • Interactions hydrophobes

• Implique aussi des liaisons covalentes :

  • Ponts disulfures : formation de ponts –S-S- entre deux cystéines en condition oxydante.

• Les éléments de structure secondaire s'associent en motifs (ou structures supersecondaires) ou en domaines.

• Un domaine est une unité fondamentale de la structure tertiaire, souvent avec une fonction propre.

Classification des domaines fonctionnels :

1. Domaines catalytiques : Impliqués dans l'activité enzymatique (ex: kinase, hydrolase).

2. Domaines de liaison : Se lient spécifiquement à d'autres molécules (ADN, ARN, etc.) (ex: zinc finger, SH2).

3. Domaines de reconnaissance et d'interaction : Participent aux interactions protéine-protéine (ex: PDZ, leucine-zipper).

4. Domaines transmembranaires : Traversent la membrane cellulaire, riches en AA hydrophobes (ex: canaux ioniques, RCPG).

5. Domaines structuraux : Contribuent à la stabilité globale de la protéine.

Structure Quaternaire

• Association de plusieurs sous-unités (identiques ou différentes).

• N'est pas systématique.

• Présence d'axes de symétrie.

• Notion de coopérativité entre sous-unités : la liaison d'un premier effecteur augmente l'affinité d'un autre ligand (allostérie).

• Exemple : l'hémoglobine, qui transporte l'oxygène, est composée de 4 groupements hème et présente une affinité pour l'O₂ dépendante de la pression locale en oxygène.

Complexes Multimériques

• Associations de plusieurs sous-unités formant des complexes fonctionnels non quaternaires.

• Exemple : l'immunoglobuline G, composée de 2 chaînes lourdes et 2 chaînes légères reliées par des ponts disulfures.

Les Propriétés Physico-Chimiques des Protéines

Solubilité

• Les protéines cytoplasmiques et extracellulaires sont généralement hydrosolubles (nombreux résidus hydrophiles en surface).

• Les protéines transmembranaires sont liposolubles (résidus hydrophobes en surface).

Caractère Amphotère

• Les protéines possèdent des charges positives et négatives, ce qui leur confère un caractère amphotère.

• Elles sont caractérisées par leur point isoélectrique (pI).

Dépendance vis-à-vis du pH et de la force ionique

• Des variations de pH et de force ionique peuvent modifier l'état d'ionisation des groupements ionisables.

• Cela impacte la structure tridimensionnelle et la fonction des protéines.

Dépendance vis-à-vis de la température

• De nombreuses protéines sont thermosensibles.

• Une augmentation de la température déstabilise les liaisons faibles, entraînant une dénaturation et une perte de fonction.

IV. Fonctions des Protéines

Les fonctions des protéines sont très variées et dépendent de leur structure tridimensionnelle. Les protéines globulaires ont des fonctions diverses, tandis que les protéines fibreuses ont des fonctions structurelles.

Moyen mnémotechnique : "PRÊNES"

Protection

• Les anticorps (immunoglobulines) sont des protéines produites par les vertébrés en réponse à des substances spécifiques, jouant un rôle clé dans l'immunité humorale.

Régulation

• Les protéines participent à la communication intra- et inter-cellulaire.

• Exemple : l'insuline et le glucagon (hormones protéiques) et leurs récepteurs régulent la glycémie.

Mouvement

• Les protéines sont impliquées dans la contraction musculaire et le mouvement cellulaire (cils, flagelles).

• Exemples : actine, myosine, troponine, dynéine.

Transport

• Les protéines transportent diverses molécules.

• Exemples :

  • L'hémoglobine transporte l'O₂ des poumons vers les tissus et le CO₂ des tissus vers les poumons.

  • L'albumine transporte les acides gras dans le sang.

Énergie

• Les protéines peuvent servir de réserves d'acides aminés comme substrats énergétiques.

• Exemples : l'ovalbumine du blanc d'œuf ou la caséine du lait.

Influx Nerveux

• Exemple : la rhodopsine est une protéine photoréceptrice des cellules de la rétine, convertissant l'énergie lumineuse en influx nerveux.

Enzymes

• Les enzymes sont des catalyseurs des réactions biologiques.

• Elles sont classées en 7 catégories principales :

1. Oxydoréductases : Catalysent les réactions d'oxydoréduction (transferts d'électrons). Ex: lactate déshydrogénase.

2. Transférases : Catalysent le transfert de groupes fonctionnels d'une molécule à une autre. Ex: hexokinase.

3. Hydrolases : Catalysent la coupure d'une liaison simple par une molécule d'eau (hydrolyse). Ex: glucose-6-phosphatase, estérases, protéases, glycosidases.

4. Lyases et synthases : Catalysent l'élimination d'un groupe d'atomes avec création d'une double liaison (lyases) ou l'ajout d'un groupe d'atomes sur une double liaison (synthases). Ex: pyruvate décarboxylase.

5. Isomérases : Catalysent l'isomérisation (transfert d'un groupe d'atomes à l'intérieur d'une molécule). Ex: phosphoglycérate mutase, alanine racémase.

6. Ligases : Catalysent la formation de liaisons C-C, C-N, C-O et C-S, assistée par l'ATP. Ex: pyruvate carboxylase.

7. Translocases : Catalysent le mouvement de molécules ou d'ions à travers les membranes cellulaires, couplé à une réaction (oxydoréduction ou hydrolyse). Ex: transporteur ABC de Na⁺, complexes TIM/TOM.

Structure

• Les protéines fibreuses soutiennent et protègent les structures biologiques.

• Exemples : le collagène du tissu conjonctif et la kératine des phanères.

V. Métabolisme des Acides Aminés et des Protéines

Le métabolisme est l'ensemble des réactions chimiques d'un organisme, divisé en catabolisme (dégradation) et anabolisme (synthèse).

• Anabolisme protéique : synthèse des acides aminés et traduction.

• Catabolisme protéique : dégradation protéique et catabolisme des acides aminés.

Anabolisme Protéique

• Les voies anaboliques sont des voies de synthèse, consommatrices d'énergie.

• La traduction protéique consomme plus de 50% de l'ATP cellulaire.

• La synthèse des acides aminés est ubiquitaire et concerne 12 acides α-aminés protéinogènes.

• La traduction est la voie métabolique ubiquitaire de synthèse des protéines.

Synthèse des Acides Aminés

• Les acides aminés sont synthétisés par des processus de transfert de la fonction amine sur des acides α-cétoniques (transaminations).

• Les transaminations sont catalysées par des transaminases (amino-transférases) utilisant le PLP (pyridoxal-phosphate).

• Les acides aminés sont également synthétisés à partir d'intermédiaires métaboliques de diverses voies : glycolyse, voie des pentoses phosphates et cycle de Krebs.

Synthèse des Protéines

• La séquence d'ADN (gène) est transcrite en ARNm puis traduite en protéine.

• La traduction convertit une séquence nucléotidique (4 lettres) en une séquence protéique (20 AA) selon le code génétique.

• Chaque codon (triplet) de l'ARNm est spécifique d'un AA. Le code génétique est redondant (ou dégénéré), un AA pouvant être codé par plusieurs codons.

• La méthionine a un seul codon (AUG), qui est aussi le codon START.

• Il existe 3 codons STOP : UAA, UAG, UGA.

• Le code génétique est dit standard (valable pour la plupart des organismes), mais pas universel (certains organismes ont des variations).

• Le cadre de lecture correspond au regroupement de nucléotides par triplets. Un seul cadre de lecture a une signification biologique (cadre de lecture ouvert ou ORF), commençant par un codon START et se terminant par un codon STOP.

• La traduction se déroule au niveau des ribosomes, complexes ribonucléoprotéiques formés de protéines et d'ARNr, composés de 2 sous-unités.

• Le ribosome lit la séquence codante de l'ARNm et catalyse la liaison des AA apportés par l'ARNt.

• Le ribosome comporte trois sites d'accommodation des ARNt :

  • Site A (Acide aminé) : accueille le nouvel ARNt avec l'AA à incorporer.

  • Site P (Peptide) : contient l'ARNt avec la chaîne peptidique en croissance.

  • Site E (Exit) : contient l'ARNt désacylé après usage.

Modifications Post-Traductionnelles (MPT)

• Après la traduction, les protéines eucaryotes peuvent subir des MPT, principalement basées sur la réactivité des chaînes latérales des AA.

• Ces modifications modulent l'activité des protéines.

• Exemples :

  • Ajout de sucres (glycosylation)

  • Ajout de lipides (palmitoylation, acylation)

  • Ajout de phosphates (phosphorylation)

  • Ajout de peptides ou protéines (sumoylation, ubiquitination)

  • Ajout de méthyles (méthylation)

  • Ajout d'acétyles (acétylation)

  • Protéolyse

Dégradations des Protéines

Les protéines cellulaires sont dégradées principalement de deux manières :

• Par le système ubiquitine-protéasome.

• Par les lysosomes.

Le Protéasome

• La majorité des protéines est dégradée dans le cytoplasme par le protéasome, un complexe multienzymatique.

• Les protéines à dégrader subissent une ubiquitination par l'action successive de 3 enzymes (E1, E2 et E3).

• La polyubiquitination est le signal d'adressage au protéasome.

• Le protéasome est composé de plusieurs types de sous-unités contenant environ 30 enzymes protéolytiques (protéases, peptidases).

Les Lysosomes

• Organites sphériques (vésicules) localisés dans le cytoplasme.

• Caractérisés par un pH acide et un contenu riche en enzymes (lipases, glycoside hydrolases, nucléases, protéases et peptidases).

Application des Protéases

• Les protéases (ou peptidases ou enzymes protéolytiques) sont des enzymes qui brisent les liaisons peptidiques des protéines (protéolyse).

• Ce processus implique l'utilisation d'une molécule d'eau, les classant parmi les hydrolases.

• Il existe plusieurs familles mécanistiques de protéases.

• Les protéases purifiées sont des outils biotechnologiques pour générer des peptides et étudier la structure primaire des protéines.

Tyr-C signifie que la protéase coupe du côté du C=O de la tyrosine. N-Leu signifie que la protéase coupe du côté du NH de la leucine. AA: acide aminé quelconque.

Catabolisme des Acides Aminés

• L'azote excédentaire libéré sous forme d'ammoniaque (toxique) est éliminé dans les urines sous forme d'urée.

• L'urée est produite dans le foie via le cycle de l'urée.

Les Apports en Acides Aminés Exogènes

• Correspondent à l'apport alimentaire en protéines.

• Après ingestion, les protéines subissent :

  • Dénaturation par l'acide chlorhydrique gastrique.

  • Digestion par la pepsine (enzyme gastrique).

  • Digestion par la trypsine, chymotrypsine, élastase, carboxypeptidase (enzymes pancréatiques).

• Les acides aminés libérés sont absorbés au niveau des villosités intestinales.

• Lorsque les AA ne sont pas utilisés pour la synthèse protéique, leur fonction amine est éliminée (en ammoniaque, acide urique ou urée).

• Leur squelette carboné est recyclé dans la gluconéogenèse (glucose-6P) ou le cycle de Krebs pour générer de l'énergie (ATP).

  VI. Méthodes et Dosages des Protéines

Les méthodes d'extraction, de purification, de séparation et de dosage des protéines sont cruciales dans de nombreux domaines (recherche, agroalimentaire, cosmétique, médical, pharmaceutique). Le choix des méthodes dépend de la matrice biologique et de l'objectif de l'étude, car il n'existe pas de méthodes universelles.

Méthodes d'Extraction

L'extraction des protéines doit les protéger et les conserver.

Notion de Tampon de Lyse

• L'extraction s'effectue dans un tampon de lyse (ex: HEPES, TRIS, PIPES).

• Il contient souvent :

  • Un agent réducteur (glutathion, acide ascorbique, β-mercaptoéthanol ou DTT) pour protéger les protéines de l'oxydation.

  • Du glycérol pour stabiliser les interactions protéine-protéine.

Inhibiteurs de Protéases

• Pour éviter l'hydrolyse des protéines d'intérêt par les protéases cellulaires, il faut maintenir un pH élevé (7-8), une température basse (4°C) et ajouter des inhibiteurs de protéases au tampon de lyse.

Les méthodes d'extraction peuvent être chimiques, mécaniques, enzymatiques ou combinées :

• Lyse par détergents : Déstructure les membranes (ex: Triton, CHAPS, NP40). Souvent combinée à des agents dénaturants (DTT, SDS, Urée, Thiouree) pour rompre les liaisons et ponts disulfures.

• Lyse par congélation/décongélation : Cycles de congélation (azote liquide) et décongélation, formant des cristaux de glace qui brisent la paroi cellulaire.

• Choc osmotique : Incubation des cellules dans une solution hypo-osmotique, parfois avec détergent et moyen mécanique.

• Ultrasonication : Ultrasons (≥ 20 kHz) pour faire vibrer et détruire les cellules. Nécessite des cycles courts et des refroidissements pour éviter la dénaturation par la chaleur.

• Méthodes mécaniques : Utilisation de broyeurs (ex: Ultraturrax) ou agitateurs (ex: Fast prep) avec abrasifs. Nécessite des cycles courts et des refroidissements.

• Digestion enzymatique : Méthode douce et sélective de déstructuration des parois cellulaires (ex: lysozyme, lyticase, polysaccharidases).

Le choix de la méthode dépend de l'origine du matériel, du matériel de départ, du résultat escompté et des applications envisagées.

Méthodes de Purification

Ces étapes visent à séparer et enrichir la protéine d'intérêt, principalement basées sur la précipitation, la sédimentation/centrifugation et la filtration.

Précipitation

La précipitation est un bon moyen de concentration, mais peut entraîner des dénaturations réversibles ou non. Elle dépend de la nature, polarité et température du solvant, de la charge de la protéine (pH), de sa conformation et hydratation, et de la présence de composés non protéiques.

• Précipitation enzymatique : Certaines enzymes provoquent la coagulation des protéines (ex: présure pour les caséines, thrombine pour le fibrinogène).

• Précipitation isoélectrique : La solubilité d'une protéine est minimale à son pHi. Une protéine dénaturée par la chaleur ou un milieu très acide précipite avec un rendement élevé à son pHi.

• Précipitation par augmentation de la force ionique (salting-out) : Une force ionique élevée neutralise les charges ioniques et compétitionne avec les protéines pour l'eau. Le sulfate d'ammonium est couramment utilisé.

• Précipitation par diminution de la constante diélectrique : Les solvants organiques à faible constante diélectrique (éthanol, acétone) réduisent l'effet solubilisant de l'eau, entraînant la formation d'agrégats.

• Coprécipitation par adsorption : Certains polymères (ex: PEG, acide polyacrylique) forment des complexes avec les protéines pour leur récupération.

Sédimentation/Centrifugation

Les protéines ont un coefficient de sédimentation défini par leur taille, forme et densité, permettant leur séparation par centrifugation.

• Centrifugation différentielle : Sépare les particules en fonction de leur masse dans un milieu de faible densité.

• Centrifugation isopycnique : Utilise un gradient de densité où les particules se stabilisent à un point égal à leur propre densité.

• Centrifugation zonale : Utilise un coussin ou un gradient où les particules s'enfoncent à des vitesses différentes selon leur coefficient de sédimentation.

Filtration

Méthode de concentration/séparation des macromolécules basée sur leurs différences de taille et de forme, utilisant des membranes semi-perméables (tamisage moléculaire).

• Filtration : jusqu'à 1000 nm (émulsion d'acides gras, bactéries).

• Micro-filtration : entre 1000 et 100 nm (virus, micelles de caséine).

• Nano-filtration : entre 100 et 10 nm (virus).

• Distinction entre filtration frontale et filtration tangentielle.

Méthodes Séparatives

Électrophorèse sur Gel

Méthode basée sur la taille et la charge des protéines. La SDS-PAGE (Sodium DodecylSulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) est la plus courante, utilisant un agent dénaturant (SDS) et un polymère de polyacrylamide pour la séparation.

Western Blot

Méthode de détection de protéines d'intérêt à l'aide d'anticorps spécifiques, détectés par chimioluminescence ou colorimétrie.

Électrophorèse Capillaire

Même principe que l'électrophorèse sur gel, mais pratiquée en milieu liquide.

Chromatographie en Phase Liquide (LC)

Divers types de LC existent :

• Chromatographie par échange d'ions (basée sur la charge).

• Chromatographie de partage (basée sur la polarité).

• Chromatographie d'affinité (basée sur le greffage d'un ligand).

• Chromatographie par exclusion stérique (basée sur la taille).

La détection est généralement réalisée par UV-visible, fluorescence ou spectrométrie de masse.

Méthodes de Dosage

• Méthode de Kjeldahl

• Méthode de Dumas

• Méthode de dosage par formol de Sorensen

• Méthodes spectrophotométriques

• Méthodes fluorométriques

• Méthodes spectrales

• Méthodes immunologiques

Méthode de Kjeldahl

• Méthode de référence pour évaluer la teneur en protéines des aliments.

• Permet le dosage de l'azote, puis par extrapolation celui des protéines.

• Trois étapes : digestion, distillation et capture/titration.

Méthode de Dumas

• Méthode concurrente de Kjeldahl.

• Consiste à amener la matrice à très haute température (>1000°C) en présence de CO₂ pour produire CO₂, H₂O et NOx.

• CO₂ et H₂O sont piégés, puis l'azote restant est dosé par catharomètre.

• Plus rapide et moins toxique que Kjeldahl, mais plus coûteuse.

Méthode de Dosage par Formol de Sorensen

• Fait réagir des protéines solubles avec du formol en présence d'une quantité connue de base (KOH ou NaOH).

• La quantité de base utilisée pour neutraliser les protons libérés est proportionnelle à la quantité d'acides aminés.

Méthodes Spectrophotométriques

• Les plus couramment utilisées pour le dosage des protéines : simples, rapides et peu coûteuses.

• Basées sur la loi de Beer-Lambert.

On distingue :

• Méthodes directes d'absorbance dans l'UV : Basées sur les longueurs d'onde 205 nm et 280 nm. Les AA aromatiques (Tyr, Trp, Phe, Cys) absorbent à 280 nm, la liaison peptidique à 205 nm.

• Méthodes indirectes par interactions protéines-chromophore : Utilisation d'un composé qui se fixe aux protéines pour former un chromophore quantifiable par absorbance. Ex: ninhydrine, méthode de Bradford (bleu de Coomassie).

• Méthodes indirectes par utilisation d'ions cuivriques : Basées sur la réaction entre les protéines et les ions cuivriques divalents Cu²⁺. Ex: méthode du Biuret, méthode de Lowry, méthode au BCA.

Méthodes Fluorométriques

• La fluorescence d'une solution diluée d'une espèce fluorescente est proportionnelle à sa concentration.

• Les protéines avec résidus Trp et Tyr émettent naturellement, mais souvent en faible quantité.

• Utilisation de sondes fluorophores (ex: BCA, OPA, Fluorescamine, FITC, Scopolétine).

Méthodes Spectrales

Dosage par des méthodes physiques basées sur l'absorption d'ondes électromagnétiques ou la charge/masse d'ions.

• Infrarouges à Transformée de Fourier (FTIR)

• Proche infrarouge (Near Infra-Red, NIR)

• Infrarouge Raman (IR-Raman)

• Spectrométrie de masse :

  • Technique d'analyse physico-chimique pour détecter, identifier et quantifier des molécules par mesure de leur masse.

  • Sépare les molécules chargées (ions) en phase gazeuse selon leur rapport masse/charge (m/z).

  • Caractérise la structure chimique des molécules par fragmentation.

  • Comprend :

    • Source d'ions : Produit des ions en phase gazeuse (ionisation douce comme ESI, MALDI ; ionisation dure comme EI).

    • Analyseur : Sélectionne les ions selon leur rapport m/z (quadrupôle, temps de vol (TOF), Orbitrap).

    • Détecteur : Détecte et compte les ions.

  • Outil clé pour la protéomique.

Méthodes Immunologiques

• Basées sur la méthode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), une méthode immuno-enzymatique basée sur une réaction antigène-anticorps spécifique.

• Des méthodologies haut-débit sont utilisées :

  • Immunodosages multiplex : Basés sur le principe de l'ELISA en sandwich, détectent une multitude de protéines ou peptides en une seule analyse (dosages planaires ou en suspension).

  • Immunodosage-MS : Couplage des tests antigène-anticorps avec la spectrométrie de masse.