Proteins: General Aspects and Study

Généralités sur les Protéines

Les protéines sont des macromolécules essentielles à toute cellule vivante, constituant plus de la moitié de la masse cellulaire hors eau. Elles jouent des rôles cruciaux et diversifiés dans le fonctionnement des organismes.

1.1 Historique des protéines

Les protéines furent découvertes à partir de 1835 par le chimiste Mulder. Le terme "protéine", apparu en 1838, vient du grec "proto" signifiant premier ou essentiel, en référence à leur importance vitale ou à leur capacité à changer de forme. Les multiples fonctions et formes des protéines n'ont été comprises qu'à partir du XXe siècle.

1.2 Définition des protéines

Les protéines sont des polymères d'acides aminés, unis par des liaisons peptidiques. Elles contiennent du carbone, de l'hydrogène, de l'oxygène, de l'azote, du soufre, et parfois du phosphore sous forme phosphorylée. Une protéine adopte une conformation native spécifique dans la cellule, essentielle à ses propriétés (fonctions enzymatiques, mécaniques, stabilité thermique).

• Rôles des protéines :

  • Enzymes : catalysent les réactions chimiques (synthèse, dégradation) du métabolisme cellulaire.

  • Structurels : cytosquelette, tissus (actine, collagène).

  • Moteurs moléculaires : mobilité (myosine).

  • Conditionnement de l'ADN : histones.

  • Régulateurs de l'expression génétique : facteurs de transcription.

  • Transmetteurs de signaux cellulaires : récepteurs membranaires, canaux voltage-dépendants ou non.

1.3 Les différents niveaux de structure

Les protéines présentent différents niveaux de structure, déterminés par la séquence en acides aminés, le niveau de maturation et l'environnement. On distingue une hiérarchie de quatre niveaux de structure.

• Structure primaire : Ordre des acides aminés le long de la chaîne polypeptidique.

• Structure secondaire : Repliements locaux réguliers (hélices, feuillets).

• Structure tertiaire : Agencement stable des structures secondaires dans l'espace.

• Structure quaternaire : Agencement de plusieurs sous-unités (chaînes polypeptidiques indépendantes).

Chaque niveau de structure contribue à la conformation native et à la fonction spécifique de la protéine.

2. La Structure Primaire

La structure primaire définit l'ordre d'enchaînement des acides aminés sans tenir compte de leur repliement dans l'espace.

• Elle est identifiée en commençant par l'extrémité N-terminale (portant une fonction amine libre) et en terminant par l'extrémité C-terminale (portant une fonction acide carboxylique libre).

• Le code à une lettre des acides aminés est souvent utilisé pour représenter cette séquence.

3. La Structure Secondaire

3.1 Définition

La structure secondaire correspond à la conformation locale du squelette de la protéine. Il s'agit d'un arrangement spatial régulier et répétitif de la chaîne, principalement stabilisé par des liaisons hydrogènes entre les groupes C=O (carbonyle) et N-H (amine) des liaisons peptidiques.

3.2 Méthodes d'études des structures secondaires et composition

Les études initiales des structures secondaires (et des modèles de structure tertiaire) ont été réalisées sur des protéines cristallisées, utilisant des méthodes comme :

• la dispersion optique rotatoire

• le dichroïsme circulaire

• la diffraction en rayons X (travaux de Perutz et Kendrew sur la myoglobine et l'hémoglobine, prix Nobel 1962).

Règles de construction :

• Tous les acides aminés sont en configuration L.

• Ils sont tous équivalents, à l'exception de la proline.

• Les chaînes latérales n'interviennent pas directement dans la structure secondaire.

• Les angles entre les valences et les distances interatomiques doivent être respectés.

• Les 4 atomes de la liaison peptidique doivent rester coplanaires en raison de la résonance.

• Les liaisons hydrogènes se forment entre les groupements carbonyle et amine de la liaison peptidique.

Les deux structures secondaires les plus fréquentes sont les hélices α et les feuillets β.

3.3 Structure secondaire en hélice : exemple de l'hélice α

Une hélice est une structure en forme de ressort, caractérisée par son pas (distance entre deux tours) et le nombre "n" de résidus par tour d'hélice.

Caractéristiques de l'hélice α :

• Elle est quasiment toujours droite (tourne dans le sens des aiguilles d'une montre).

• Formée par un enroulement régulier d'une chaîne polypeptidique.

• Chaque groupe -NH d'un acide aminé forme une liaison hydrogène avec le groupe C=O du 4^e acide aminé le précédant (liaisons H intramoléculaires).

• Ces liaisons H stabilisent fortement la structure.

• Angles des liaisons peptidiques (PHI et PSI) à environ -57° et -47°.

• Pas de l'hélice : 0,54 nm.

• Les atomes sont très compactés, favorisant les interactions de Van Der Waals.

• La distance N-O des liaisons H est d'environ 2,86 Å.

• Les radicaux des chaînes latérales sont orientés radialement vers l'extérieur de l'hélice.

• La nature des chaînes latérales peut conférer un caractère :

  • Hydrophobe : majorité de chaînes latérales hydrophobes.

  • Amphiphile : un côté hydrophobe, l'autre hydrophile, permettant l'assemblage vers la structure tertiaire.

3.4 Les feuillets plissés β

1. Définition

   Les feuillets β sont constitués de portions de chaînes polypeptidiques repliées côte à côte. Les liaisons hydrogènes s'établissent entre les carbonyles (C=O) et les groupements -NH de liaisons peptidiques de chaînes voisines (liaisons H intermoléculaires), stabilisant ainsi l'alignement ordonné des brins.

   • Les brins peuvent être :

     • Parallèles : les extrémités N-terminales des chaînes voisines sont du même côté.

     • Anti-parallèles : les N-terminales et C-terminales s'alternent.

   • Les liaisons H sont plus fortes dans les feuillets anti-parallèles, ce qui explique leur fréquence plus élevée.

   • Ces feuillets confèrent une structure en zigzag étirée, et sont stabilisés par liaisons hydrogènes intermoléculaires.

2. Acides aminés impliqués dans les feuillets β

   • Les acides aminés aromatiques (tyrosine, tryptophane, phénylalanine) et ceux avec chaînes latérales ramifiées (thréonine, valine, isoleucine) sont fréquemment retrouvés au cœur des feuillets β.

   • La proline est souvent située aux extrémités des brins β en raison de sa fonction imine particulière, évitant l'agrégation.

3.5 Les autres structures secondaires : boucles et coudes

• Les coudes :

  • Segments polypeptidiques qui relient deux structures secondaires répétitives (hélices α, feuillets β).

  • Situés majoritairement à la surface des protéines.

  • Souvent appelés "épingles à cheveux de type β" (β hairpin) quand leurs extrémités sont parallèles.

• Les boucles oméga (Ω) :

  • Contiennent parfois plusieurs coudes β, de forme compacte.

  • Les chaînes latérales remplissent l'intérieur de leur cavité.

• Pelotes statistiques :

  • Zones sans structure définie, ni axe de symétrie, présentes dans la plupart des protéines.

Pour la représentation schématique : les hélices α sont des cylindres, les feuillets β sont des flèches indiquant le sens du brin.

4. La Structure Tertiaire

4.1 Définition et fonction

La structure tertiaire est la conformation spatiale tridimensionnelle unique qu'adopte une protéine. Elle résulte du repliement des structures secondaires (hélices α, feuillets β, coudes) et des segments sans structure définie, sous l'influence de facteurs environnementaux (température, force ionique, pH, solvant).

• Elle décrit l'architecture et la topologie de la protéine dans l'espace.

• En milieu aqueux, les résidus hydrophobes sont majoritairement à l'intérieur de la protéine, tandis que les acides aminés polaires sont en surface.

• Cette organisation spatiale détermine la fonction spécifique de la protéine (par exemple, la constitution de sites actifs enzymatiques).

• La conformation adoptée correspond au niveau énergétique minimum.

4.2 Stabilisation de la structure tertiaire

1) Les différentes liaisons

La structure tertiaire est stabilisée principalement par des interactions faibles non-covalentes, mais aussi par des liaisons covalentes dans certains cas.

Interactions faibles non-covalentes :

• Interactions électrostatiques

• Liaisons hydrogènes

• Interactions de Van Der Waals

• Interactions hydrophobes

Liaisons covalentes :

• Les ponts disulfures : formés par oxydation des groupes sulfhydriles (-SH) de deux cystéines, créant une cystine (liaison S-S).

  • Peuvent être intramoléculaires (boucles internes) ou intermoléculaires (reliant deux chaînes, comme dans l'insuline).

2) Les liaisons hydrogènes

Les liaisons hydrogènes sont des interactions électrostatiques et de Van Der Waals entre un atome électronégatif (oxygène ou azote) et un atome d'hydrogène lui-même lié à un atome électronégatif.

• Distance entre les atomes électronégatifs : environ 3 Å.

• Énergie de liaison : environ 3 kcal.mol⁻¹.

• Stabilisent les structures secondaires (feuillets β, hélices) et peuvent lier les sous-unités d'un oligomère.

• Exemples entre chaînes latérales d'acides aminés polaires : alcool/acide (Asp, Tyr), deux acides (Asp, Glu), alcool/amine (Ser, Lys), alcool/amide (Ser, Asn), deux alcools (Ser, Thr, Tyr).

• Les acides aminés polaires, formant des liaisons H avec l'eau, sont donc hydrophiles et se dissolvent facilement.

3) Les ponts salins

Interactions électrostatiques entre résidus chargés négativement (aspartate, glutamate, C-terminale) et résidus chargés positivement (lysines, arginines, histidines, N-terminale). Exemple : entre glutamate 200 et lysine 204 dans la protéine prion.

4) Les interactions de Van Der Waals

Interactions entre les nuages électroniques de deux atomes adjacents. Attractives à des distances de 3-4 Å. Énergie de liaison de l'ordre de 1 kcal.mol⁻¹.

• Malgré leur faible énergie individuelle, leur grand nombre les rend cruciales pour la stabilisation et le compactage des protéines.

• Elles deviennent répulsives si la distance entre atomes est trop faible.

5) Les interactions hydrophobes

Interactions entre chaînes latérales non polaires qui se repoussent de l'eau et des groupes polaires, s'attirant mutuellement pour minimiser le contact avec l'eau. Contribuent au compactage des protéines en milieu aqueux.

Les liaisons stabilisant la structure tertiaire sont sensibles à:

4.3 La notion de domaine

Certaines parties d'une chaîne polypeptidique peuvent adopter des conformations indépendantes du reste de la chaîne pour former des domaines. Ces régions (50 à 350 acides aminés) présentent une activité fonction

nelle spécifique (catalytique, de liaison) et peuvent contenir des hélices α et des feuillets β. Chaque domaine a généralement une fonction biologique propre. Les domaines peuvent être conservés au cours de l'évolution.

Les structures super-secondaires sont des combinaisons simples d'éléments de structure secondaire qui forment une structure tertiaire et se retrouvent dans de nombreuses protéines, souvent associées à une fonction biologique.

Exemples de motifs structuraux :

1. Leucine zipper :

   • Motif décrit fin des années 80.

   • Hélice amphipathique où une leucine est présente tous les sept résidus sur huit tours d'hélice.

   • Permet la dimérisation de protéines, notamment des facteurs de transcription comme AP-1, grâce à des domaines basiques qui interagissent avec l'ADN.

2. Hélice-boucle-hélice (bHLH) :

   • Deux hélices α reliées par une petite boucle.

   • Retrouvé dans les facteurs de transcription (ex: Myc, MyoD) pour interagir avec le grand sillon de l'ADN.

   • Ces facteurs sont souvent dimériques, chaque monomère ayant une hélice basique facilitant la liaison à l'ADN.

3. Hélice-coude-hélice :

   • Motif présent dans les protéines interagissant avec l'ADN.

   • Deux hélices α (N-terminale et C-terminale) assurent reconnaissance et liaison à l'ADN. L'hélice C-terminale est souvent la plus impliquée dans la reconnaissance, l'hélice N-terminale stabilise l'interaction.

4. Autres motifs structuraux :

   • Motif βaβ : deux brins β parallèles reliés par une α-hélice.

   • Motif méandre-β : association de deux ou plusieurs brins β anti-parallèles consécutifs reliés par des boucles en épingle à cheveux.

   • Motif en clé grecque : brins de feuillets β liés par liaisons H, pouvant être non adjacents dans la structure primaire.

   • Tonneau TIM (ou ) : alternance typique de 8 hélices α et 8 feuillets β. Un exemple est la tri-phosphate isomérase.

5. La Structure Quaternaire

5.1 Définition

La structure quaternaire est l'organisation spatiale d'assemblages de plusieurs molécules protéiques (sous-unités ou monomères) ayant chacune atteint une structure tertiaire. Elle résulte de l'association de ces sous-unités pour former une entité fonctionnelle plus grande.

• La masse molaire peut dépasser plusieurs millions de Dalton.

• L'agencement des sous-unités est stabilisé principalement par des interactions non-covalentes, mais aussi par des liaisons covalentes.

• Les zones de contact entre sous-unités sont similaires aux interactions internes de la structure tertiaire (chaînes latérales non polaires regroupées, liaisons H).

• Des ponts disulfures intercaténaires (entre chaînes) peuvent aussi stabiliser la structure quaternaire.

• L'assemblage peut être homo-multimérique (sous-unités identiques) ou hétéro-multimérique (sous-unités différentes).

5.2 Stabilisation de la structure quaternaire

La structure quaternaire est stabilisée par diverses liaisons inter-chaînes :

• Liaisons covalentes (ponts disulfures)

• Liaisons hydrogène

• Liaisons ioniques

• Interactions hydrophobes

• Interactions de Van Der Waals

6. Les Modifications Post-Traductionnelles (MPT) des Protéines

Les modifications post-traductionnelles sont des altérations chimiques des protéines après leur synthèse, essentielles pour leur fonction biologique, localisation, et régulation. Elles consistent en l'ajout ou le retrait de groupements divers, principalement sur les chaînes latérales des acides aminés.

Exemples de MPT :

• Acétylations : principalement sur les histones, affectant le degré de compaction de la chromatine/nucléosome et régulant l'expression génique.

• Amidations

• Biotinylations : l'ajout de biotine sur la lysine (pour former la biocytine).

  • In vivo : transforme des apocarboxylases inactives en holocarboxylases

actives.

• In vitro : permet de marquer sélectivement des protéines pour l'utilisation comme sondes (ex: système streptavidine-biotine).

• Carboxylations : sur le glutamate.

• Hydroxylations : sur la lysine, la proline.

• Méthylations : sur la lysine, l'arginine.

• Phosphorylations : ajout d'un groupement phosphate sur les sérines, thréonines ou tyrosines.

  • Réalisées par des kinases (transfert enzymatique du phosphate terminal de l'ATP).

  • Un rôle majeur dans l'activation ou désactivation des protéines, régulant les voies métaboliques et de signalisation intracellulaires.

  • La déphosphorylation est assurée par des phosphatases.

6.2 Modifications par ajout de glucides : glycosylation

La glycosylation est l'ajout de résidus glucidiques sur les protéines. Elle est cruciale pour la protection contre la dégradation, la stabilité cellulaire, le guidage vers les organites et la reconnaissance cellulaire, notamment sur les protéines transmembranaires extracellulaires.

• O-Glycosylation : liaisons O-glycosidiques sur les chaînes latérales hydroxylées (thréonine, sérine).

• N-Glycosylation : liaisons N-glycosidiques sur les résidus asparagines (Asn), les plus fréquentes.

• Ces glycosylations sont vitales pour la signalisation et la reconnaissance cellulaire, comme dans les anticorps où des modifications peuvent être impliquées dans des pathologies (ex: glomérulonéphrite à IgA).

6.3 Modification par ajout d'un groupement lipidique

Ces modifications sont importantes pour l'adressage des protéines aux membranes.

• Glypiation : liaison d'un glycosyl-phosphatidylinositol (GPI) à un acide aminé en position C-terminale. Augmente la mobilité de la protéine dans la membrane.

• Isoprénylation/Farnésylation : liaisons entre une cystéine et un isoprène.

• S-acylations : liaisons à l'acide myristique ou palmitique.

7. Classification des Protéines

7.1 Classification selon leur composition

• Holoprotéines : Protéines simples, composées uniquement d'acides aminés.

• Hétéroprotéines : Protéines composées d'une partie protéique (apoprotéine) et d'une partie non protéique (groupement prosthétique, un cofacteur fortement lié).

  • Exemple : l'hémoglobine (protéine + groupements héminiques).

  • Classées selon leur groupement prosthétique :

    • Nucléoprotéines

    • Glycoprotéines

    • Lipoprotéines

    • Phosphoprotéines

    • Chromoprotéines (flavoprotéines, hémoprotéines, etc.)

    • Métalloprotéines

7.2 Classification selon leur structure tridimensionnelle

• Protéines globulaires (ou sphéroprotéines) :

  • Chaînes repliées en formes compactes, ovoïdes.

  • Souvent situées dans le cytoplasme, mobiles, rôle dynamique.

  • Solubles, sensibles à la dénaturation (ex: albumine, histones, globulines, hormones).

• Protéines fibreuses (ou scléroprotéines) :

  • Aspect de fibres minces.

  • Insolubles dans l'eau et parfois dans aucun solvant.

  • Rôle structurel (ex: kératine dans les cheveux, collagène dans les os, élastine).

• Associations de protéines globulaires et fibreuses :

  • Exemple : protéines contractiles des fibres musculaires (myosine est globulaire, actine est globulaire, tropomyosine est fibreuse, troponine est globulaire).

8. Propriétés Physico-Chimiques des Protéines

Les protéines, molécules très hétérogènes, possèdent des propriétés variables influencées par leur taille, composition, charge et solubilité.

8.1 La taille

• Les protéines ont des formes et des tailles très diverses, même pour un nombre d'acides aminés similaire (ex: une sphère de 300 acides aminés de 4,3 nm peut devenir une hélice α de 45 nm).

8.2 Le poids moléculaire

• Exprimé en Dalton (Da) ou kiloDalton (kDa). 1 Da = 1,66.10⁻²⁴ g.

• Vary de 6000 Da à plusieurs millions.

• Peut être calculé à partir de la séquence primaire (en tenant compte de la perte d'eau lors de la formation des liaisons peptidiques).

• Mesuré par diverses méthodes physico-chimiques :

  • Delta cryoscopique

  • Pression osmotique (loi de Van't Hoff)

  • Diffusion de la lumière

  • Chromatographie d'exclusion

  • Ultracentrifugation

  • Ultrafiltration

8.3 La composition en acides aminés

• Déterminée par hydrolyse acide, suivie d'une analyse chromatographique des acides aminés.

• Le tryptophane est détruit par cette méthode ; la méthionine et la cystéine/cystine nécessitent une oxydation performique préalable pour les stabiliser (méthionine sulfone, acide cystéique).

8.4 Séquence en acides aminés

• Déterminée par :

  • Méthode de Sanger (détermination de l'AA N-terminal).

  • Méthode d'Edman (dégradation récurrente) : automatisée, permet jusqu'à une quinzaine de cycles.

8.5 La charge

• Les protéines sont des molécules amphotères, possédant au moins deux fonctions acido-basiques (extrémités N et C-terminales) et de nombreuses chaînes latérales ionisables.

• La charge globale dépend du bilan des charges de tous les sites acido-basiques et varie avec le pH du milieu.

  • À pH neutre :

    • Neutre si autant de charges positives que négatives.

    • Positive si plus d'AA basiques.

    • Négative si plus d'AA acides.

  • Le point isoélectrique (pHi) est le pH où la charge globale de la protéine est nulle (forme zwitterion).

  • Le comportement dans un champ électrique dépend de cette charge globale.

8.6 La solubilité

1) Solubilité en fonction du pH

• La solubilité d'une protéine est minimale à son pHi.

• À ce pH, les intéractions avec l'eau (liaisons hydrogènes) sont minimales car la protéine est moins solvatée, ce qui favorise la précipitation.

2) Solubilité en fonction de la force ionique

La courbe de solubilité en fonction de la force ionique présente deux phases :

• Phase A (salting-in) : À faible force ionique, une légère augmentation de la force ionique augmente la solubilité en stimulant le caractère polaire de la protéine et ses interactions avec l'eau.

• Phase B (salting-out ou relargage par les sels) : À forte force ionique, les sels mobilisent les molécules d'eau, les retirant du contact avec la protéine. Cela entraîne une précipitation des protéines, utilisée pour leur purification à partir de mélanges biologiques.

8.7 Estimation du pH d'une protéine

1) Formule et règles

• Le pHi correspond au pH où la protéine est sous forme zwitterion.

• Estimation par l'équation: , où pKa1 et pKa2 sont les pKa des couples acido-basiques impliqués dans la formation du zwitterion.

2) Exemple

• Pour une protéine à quatre acides aminés (Ala, Asp, Lys, Gly) avec différents pKa (extrémité N-terminale, C-terminale, chaînes latérales), on détermine les charges globales à différents pH.

• Le pHi est la zone de pH où la charge globale est nulle. Une approximation de pHi peut être calculée comme la moyenne des pKa encadrant cette zone de neutralité.

9. Méthodes d'étude des Protéines

9.1 Méthodes de dosage global des protéines

• Spectrophotométrie à 280 nm : Utile pour les acides aminés aromatiques (tyrosine, tryptophane), mais sensible aux interférences d'autres substances absorbant à cette longueur d'onde.

• Réaction du Biuret : Formation d'un complexe violet proportionnel à la quantité de liaisons peptidiques en présence d'ions cuivre en milieu alcalin.

• Technique de Lowry :

Technique colorimétrique associée au dosage de la tyrosine, très sensible pour les protéines solubles.

• Technique de Bradford : Adaptée aux protéines membranaires, car elle tend à casser les membranes pour libérer les protéines.

• Colorations spécifiques : (Bleu de bromophénol, Rouge Ponceau, Bleu de Coomassie, nitrate d'argent) Révèlent la présence de protéines sans dosage.

  • Le Bleu de Coomassie est utilisé pour révéler les résultats d'électrophorèses sur gel, mais la coloration est irréversibles.

  • Le Rouge Ponceau est une coloration réversible, utile après transfert sur membranes de nitrocellulose pour des expériences ultérieures.

9.2 L'électrophorèse

L'électrophorèse est une technique de séparation de molécules chargées (protéines, acides aminés, peptides) par leur migration différentielle sous l'influence d'un champ électrique.

Principes généraux :

• Utilise un gel d'acrylamide avec des puits pour déposer les échantillons.

• Un champ électrique est appliqué entre une cathode et une anode, via un tampon de migration.

Types d'électrophorèse :

• Électrophorèse simple en milieu acide ou basique :

  • Le pH du tampon détermine la charge de la protéine.

  • Si pH_tampon < pHi_protéine, la protéine est chargée positivement (cation) et migre vers la cathode négative.

  • Si pH_tampon > pHi_protéine, la protéine est chargée négativement (anion) et migre vers l'anode positive.

  • Le pH est le critère de séparation principal.

• Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) :

  • Utilise le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), un détergent puissant qui rompt les liaisons non-covalentes, dénaturant la protéine.

  • Le complexe SDS-protéine est chargé négativement proportionnellement à la longueur de la chaîne.

  • La charge nette de la protéine devient négligeable; la séparation ne dépend plus que du poids moléculaire.

  • Le β-mercaptoéthanol est ajouté pour rompre les ponts disulfures (internes ou inter-chaînes).

  • Le gel de polyacrylamide agit comme un tamis; les petites protéines migrent plus loin.

  • La concentration d'acrylamide peut être variée selon la taille des protéines à séparer.

  • La révélation se fait avec du nitrate d'argent ou du bleu de Coomassie.

  • Une courbe étalon (log de la masse molaire vs. mobilité relative) permet de déterminer le poids moléculaire apparent par interpolation.

9.3 La chromatographie d'exclusion (ou de tamisage moléculaire)

Cette technique sépare les protéines à travers un gel poreux en fonction de leur poids moléculaire.

• Phase stationnaire : Billes poreuses de diamètre contrôlé.

• Phase mobile : Un solvant ou tampon pH.

• Principes de séparation :

  • Les protéines de taille supérieure aux pores ne pénètrent pas dans les billes et sont éluées en premier (dans le volume mort de la colonne).

  • Les protéines de taille inférieure aux pores pénètrent dans les billes. Plus elles sont petites, plus elles interagissent avec les pores, subissent de frottements, et sont éluées tardivement.

  • Ces colonnes sont étalonnées avec des marqueurs de poids moléculaire pour établir une corrélation entre le volume d'élution et le poids moléculaire, permettant ainsi de déterminer le poids moléculaire des protéines étudiées.