Cm3 biomol

Les cours magistraux ont couvert la réplication de l'ADN, un processus fondamental en biologie moléculaire. Le résumé ci-dessous met l'accent sur les acteurs clés, les mécanismes et les spécificités chez les procaryotes et les eucaryotes, ainsi que sur les applications biotechnologiques des polymérases et les implications thérapeutiques.

1. Réplication de l'ADN : Principes Généraux

La réplication de l'ADN est un processus semi-conservatif, où chaque brin de la double hélice parentale sert de matrice à la synthèse d'un nouveau brin, résultant en deux molécules d'ADN filles, chacune composée d'un brin ancien et d'un brin nouvellement synthétisé. Ce mécanisme se déroule en trois étapes principales : initiation, élongation et terminaison.

1.1. Propriétés des ADN polymérases

• ADN polymérase ADN-dépendante : utilise une matrice d’ADN pour synthétiser un nouveau brin.

• Sens de synthèse : toujours 5’ → 3’.

• Substrats : désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP).

• Nécessite une amorce pour initier la synthèse (ARN in vivo).

• Activité de correction d’erreur (proofreading) : exonucléase 3’ → 5’, ce qui augmente fortement la fidélité.

• Taux d’erreur :
  

  • ADN Pol III : ≈ 1/10⁵

  • avec relecture : ≈ 1/10⁷

  • taux global de la réplication : ≈ 1/10¹⁰ paires de bases

1.2. Principaux acteurs de la réplication

1.2.1. Hélicases

• Assurent la dénaturation (= séparation des deux brins).

• Hexamères formant un anneau autour d’un brin d’ADN.

• Utilisent de l’ATP.

• Exemple : Mcm2-7 chez les eucaryotes.

• Nécessitent un poseur d’hélicase pour être chargées sur l’ADN.

1.2.2. Protéines de liaison à l’ADN simple brin (SSBPs / RPA)

• SSBP : chez les procaryotes.

• RPA (Replication Protein A) : chez les eucaryotes.

• Se fixent sur l’ADN simple brin pour le stabiliser et empêcher le ré-appariement.

1.2.3. Topoisomérases

• Enlèvent les surenroulements positifs créés en avant de la fourche de réplication (à cause de l’ouverture par l’hélicase).

• Peuvent introduire des super-tours négatifs en arrière de la fourche.

• Leur inhibition bloque la réplication.

• Interviennent aussi dans la séparation des molécules filles en fin de réplication : topoisomérase II (aussi appelée résolvase).

1.2.4. Primase

• ARN polymérase ADN-dépendante.

• Synthétise des amorces d’ARN (8–14 nucléotides) indispensables pour que l’ADN polymérase démarre.

• Activité stimulée par son association avec l’hélicase, ce qui la limite aux fourches de réplication.

• Exemples :
  

  • DnaG chez les procaryotes.

  • Chez les eucaryotes : associée à l’ADN pol α (hPrimpol) dans un complexe :
    

    • 2 sous-unités de primase + 2 sous-unités d’ADN pol α

    • permet le passage ARN → ADN (début de l’élongation).

1.2.5. Clamp (anneau coulissant)

• Anneau protéique qui augmente la processivité de l’ADN polymérase.

• Forme :
  

  • PCNA : trimère chez les eucaryotes

  • protéine β : dimère chez les bactéries

• Placé sur l’extrémité 3’ de l’amorce par une protéine d’assemblage du clamp :
  

  • RFC chez les eucaryotes

  • complexe γ chez les bactéries

• Permet de garder l’ADN polymérase fixée → synthèse très rapide (jusqu’à ~1000 nt/s).

1.2.6. ADN polymérases spécifiques

Procaryotes

• Pol I : enlève les amorces d’ARN, participe à la réparation ; possède :
  

  • une activité exonucléase 3’ → 5’ (relecture)

  • une activité exonucléase 5’ → 3’

• Pol II : réparation.

• Pol III : réplication du chromosome ; activité exonucléase 3’ → 5’ (relecture).

Eucaryotes

• Pol α : initiation (avec la primase), élongation des amorces, amorces des fragments d’Okazaki.

• Pol δ : élongation du brin discontinu, réparation, excision de nucléotides.

• Pol ε : élongation du brin continu, réparation.

• Pol γ : réplication de l’ADN mitochondrial.

• Télomérase : maintenance des télomères.

Protéines de liaison à l’ADN simple brin (SSBPs / RPA)

• SSBP : chez les procaryotes.

• RPA (Replication Protein A) : chez les eucaryotes.

• Elles se fixent sur l’ADN simple brin pour le stabiliser et empêcher le ré-appariement (et la formation de structures secondaires).

2. L’élongation : fonctionnement de la fourche de réplication

2.1. Synthèse continue et discontinue

• La synthèse d’ADN se fait toujours 5’ → 3’.

• Le brin direct (brin continu) est synthétisé sans interruption, dans le même sens que le déplacement de la fourche.

• Le brin retardé (brin discontinu) est synthétisé par fragments (fragments d’Okazaki), dans le sens opposé au déplacement global de la fourche.
  

  • Taille des fragments d’Okazaki :
    

    • procaryotes : 1000–2000 nt

    • eucaryotes : 100–400 nt

  • Chaque fragment commence par une amorce d’ARN.

2.2. Modèle du trombone

• Le réplisome est l’ensemble des complexes protéiques qui assurent la réplication.

• Le modèle du trombone explique comment les deux brins sont synthétisés en même temps, alors qu’ils ont des sens de synthèse contraints.

• Sur le brin discontinu, une boucle se forme : cela permet à la polymérase du brin retardé de garder le même “sens global” de déplacement que le réplisome.

• Deux ADN polymérases sont impliquées : une pour chaque brin.

• Le chargeur de clamp joue un rôle central dans l’organisation du complexe.

2.3. Réplication de l’ADN chromatinien chez les eucaryotes

• In vivo, l’ADN eucaryote est associé aux histones sous forme de chromatine.

• Des chaperons d’histones (ex : FACT, Asf1) sont recrutés (notamment via l’hélicase) pour prendre en charge les nucléosomes parentaux.

• Après le passage de la fourche, les nucléosomes sont réassemblés sur l’ADN néo-synthétisé grâce aux interactions entre chaperons, ADN polymérases, PCNA et RPA.

3. L'Initiation de la Réplication

3.1. Modèle du réplicon

• Chaque unité d'ADN répliquée à partir d'une origine de réplication est appelée réplicon.

• L'initiation est contrôlée par :

  • Un initiateur : protéine nécessaire à l'initiation.

  • Un réplicateur : séquences cis-suffisantes pour la réplication, constitué de sites de fixation pour l'initiateur et de séquences riches en A/T facilitant la dénaturation.

  • L'origine de réplication est la zone où débute la réplication, incluse dans le réplicateur.

3.2. Initiation chez les procaryotes (ex :

E. coli

)

• Initiateur : DnaA

• Réplicateur : OriC (un par chromosome)

Mécanisme

1. Fixation de DnaA sur des séquences spécifiques d’OriC.

2. L’assemblage de plusieurs molécules de DnaA induit la dénaturation de la région riche en A/T d’OriC.

3. L’hélicase est chargée sur l’ADN dénaturé grâce à son poseur d’hélicase.

4. L’hélicase commence à ouvrir l’ADN et déplace progressivement les protéines DnaA.

5. Interaction hélicase–primase, puis synthèse d’une amorce d’ARN, d’abord sur le brin précoce (brin continu).

.3. Initiation chez les eucaryotes

• La synthèse d’ADN a lieu pendant la phase S du cycle cellulaire.

• En moyenne, on trouve une origine tous les ~30 000 pb.

• Structures spécifiques :
  

  • chez la levure, les origines correspondent à des séquences ARS (Autonomously Replicating Sequences), souvent riches en A/T.

Couplage au cycle cellulaire

1. Phase G1 : sélection (licensing) des origines de réplication
   

   • Fixation de ORC (Origin Recognition Complex) sur l’origine.

   • Association de Cdc6, puis recrutement des facteurs nécessaires au chargement de l’hélicase Mcm2-7 (chargée mais inactive).

3. Début de phase S (pré-phase S) : activation des kinases du cycle
   

   • Activation de CDK et DDK, qui phosphorylent ORC, Cdc6 et Cdt1.

   • La phosphorylation de ORC entraîne son détachement, ce qui empêche une réinitiation multiple (donc évite une réplication excessive / polyploïdie).

5. Activation de l’hélicase
   

   • Mcm2-7 est activée grâce à des facteurs activateurs, notamment GINS et CDC45.

7. Démarrage de la synthèse
   

   • Interaction hélicase–primase, puis synthèse des amorces d’ARN (puis relais par les polymérases réplicatives).

• Après la phase S, ORC reste phosphorylée et ne peut pas se réassocier à une nouvelle origine, ce qui évite une réplication en excès.

4. Terminaison de la Réplication et Maintien des Télomères

4.1. Remplacement des fragments d'Okazaki chez les procaryotes

1. Dégradation des amorces ARN par la RNAse H (qui dégrade l'ARN dans un hybride ARN/ADN) et par l'activité 5'-3' exonucléase de l'ADN Pol I.

2. Synthèse d'ADN par l'ADN Pol I pour combler les espaces.

3. La ligase lie les fragments d'ADN pour former un brin continu.

4. Les topoisomérases de type II (résolvase) séparent les molécules filles entrelacées.

<h3>4.2. Remplacement des fragments d'Okazaki chez les eucaryotes</h3>
<ul>
<li>Processus similaire mais sans ADN Pol I ni RNAse H intervenant directement.</li>
<li>Une <mark>endonucléase llamada Fen1</mark> (Flap Endonuclease 1) excise les amorces ARN et les fragments de l'ADN qui s'y rattachent.</li>
<li>La <mark>ligase</mark> assure la liaison finale.</li>
</ul
>
<h3>4.3. Réplication des télomères</h3>
<ul>
<li>Les <mark>télomères</mark> sont des séquences répétées non accessibles à la réplication conventionnelle d'ADN.</li>
<li>Ils sont répliqués par la <mark>télomérase</mark>, une enzyme constituée de :
<ul>
<li><b>TER</b> : un ARN servant de matrice (<mark>télomérase ARN</mark>), complémentaire des séquences télomériques.</li>
<li><b>TERT</b> : une <mark>télomérase reverse transcriptase</mark> (ADN polymérase ARN-dépendante).</li>
</ul>
</li>
<li>La télomérase est active dans les cellules germinales et les cellules souches, mais absente ou peu active dans la plupart des cellules somatiques adultes, ce qui entraîne un raccourcissement des télomères à chaque division et limite leur potentiel réplicatif ("catastrophe mitotique").</li>
<li>Les télomères forment une structure en <mark>boucle-t</mark> associée à des protéines de réparation, les protégeant de la dégradation.</li>
</ul>

5. Applications Biotechnologiques des ADN Polymérases

5.1. PCR (Polymerase Chain Reaction)

• Amplification in vitro d'un fragment d'ADN spécifique.

• Nécessite : ADN matrice, dNTPs, amorces complémentaires des extrémités du fragment, et une Taq polymérase (résistante à la chaleur).

• Étapes : Dénaturation de l'ADN, hybridation des amorces, élongation par la Taq polymérase.

• Taq polymérases :

  	Taq DNA polymérase	Pfu DNA polymérase
  Activité 5'->3' exonucléase	OUI	NON
  Activité 3'->5' exonucléase (proofreading)	NON	OUI
  Activité terminale transférase	OUI (ajoute un A en 3' sans matrice)	NON
  Taux d'erreur ()	4.91	1.90
  Taille fragment ()	≤ 10	≤ 5

<h3>5.2. Séquençage de Sanger</h3>
<ul>
<li>Méthode de référence pour le séquençage d'ADN, utilisant des didésoxyribonucléotides (ddNTPs) qui arrêtent la synthèse d'ADN.</li>
<li>Utilise une ADN polymérase (ex: la séquénase), une amorce, dNTPs et un faible pourcentage de ddNTPs marqués.</li>
<li>Permet de déterminer la séquence nucléotidique d'un brin d'ADN.</li>
</ul>

<h3>5.3. Remplissage d'extrémités (ADN polymérase de Klenow)</h3>
<ul>
<li>Le <mark>fragment de Klenow</mark> est une version tronquée de l'ADN Pol I d'<i>E. coli</i>, conservant les activités polymérase 5'-3' et exonucléase 3'-5' (proofreading), mais perdant l'activité exonucléase 5'-3'.</li>
<li>Utilisé pour synthétiser les fragments complémentaires et remplir les extrémités simples brins d'un ADN.</li>
<li>Application : synthèse de sondes de marquage (<i>random priming</i>).</li>
</ul>

6. La Réplication comme Cible Thérapeutique

Des molécules interagissant avec la réplication de l'ADN sont utilisées en médecine :

• Analogues de nucléotides :

  • 5-fluorouracile (chimiothérapie) : inhibe la synthèse des bases.

  • AZT (antiviral, par ex. contre le VIH) : inhibe les transcriptases inverses virales.

• Inhibiteurs des ADN polymérases :

  • Sarcomycine : inhibe ADN Pol I et II.

• Inhibiteurs des topoisomérases :

  • Novobiocine, acide nalidixique, ciprofloxacine, podophyllotoxines : bloquent le cycle de réplication en empêchant la relaxation de l'ADN.

• Intercalants de l'ADN :

  • Bloquent le mouvement des ADN polymérases en s'insérant entre les bases de l'ADN.

• Agents alkylants / Psoralène :

  • Lient les deux brins d'ADN, formant des dommages qui bloquent la réplication.

7. Points clés à retenir

• La réplication est un processus semi-conservatif, hautement coordonné et fidèle.

• De nombreuses protéines interagissent pour former le réplisome, assurant la progression de la fourche.

• La synthèse est continue sur le brin direct et discontinue sur le brin retardé (fragments d'Okazaki).

• L'initiation de la réplication est strictement régulée, surtout chez les eucaryotes, pour garantir une seule réplication par cycle cellulaire.

• Les télomères sont des structures spéciales répliquées par la télomérase, essentielle à la stabilité génomique.

• Les ADN polymérases sont des outils essentiels en biotechnologie (PCR, séquençage).

• Les mécanismes de réplication sont des cibles thérapeutiques importantes en cancérologie et infectiologie.

Le TD fournit des exercices pratiques pour appliquer ces concepts, notamment sur la cartographie de restriction, la PCR, le sous-clonage, la RT-PCR, le séquençage et l'analyse de l'expression génique et de la régulation de la tra