UE1F mémo sur l imagerie des structures cellulaires

→ La longueur d’onde du faisceau constitue une limite fonctionnelle pour la résolution.
→ On ne peut pas observer des éléments plus petits que la valeur imposée par cette longueur d’onde.

→ Le deuxième groupe optique est l’oculaire.
→ Il est positionné de sorte que l’image soit dans son plan focal.
→ L’œil peut alors observer l’image sans avoir à accommoder, ce qui permet un meilleur confort visuel.

→ Le système place l’objet à une distance inférieure au double de la distance focale de l’objectif.
→ Il se forme ainsi une image réelle, renversée et plus grande que l’objet.

→ L’observation est facilitée lorsque le matériel est contrasté.
→ Cela peut être le cas lorsqu’il est : naturellement coloré ; ou soumis à un traitement spécial permettant à certaines parties d’absorber les photons de certaines longueurs d’onde.

→ La résolution désigne sa capacité à séparer des détails très voisins.
→ À cause des propriétés ondulatoires de la lumière et de la diffraction, l’image d’un point n’est pas un point mais une tache.
→ Deux points proches peuvent donc apparaître comme chevauchants.

→ La limite de résolution correspond à la plus petite distance en dessous de laquelle deux points voisins paraissent confondus.
→ Elle dépend : de la longueur d’onde d’illumination ; de l’indice de réfraction en sortie d’objectif ; de l’ouverture numérique de l’objectif, c’est-à-dire du demi-angle d’ouverture du cône lumineux entrant dans l’objectif.

→ Les microscopes sont quasiment systématiquement équipés d’une caméra vidéo numérique.
→ Les caméras CCD comprennent : un dispositif de chargement couplé ; un système de refroidissement, destiné à réduire les bruits de fond.

→ Le système de refroidissement permet de réduire les bruits de fond de la caméra CCD.
→ Cela permet d’observer les cellules pendant de longues périodes avec un faible éclairage.
→ Le faible éclairage limite les effets nocifs liés à une augmentation de la température de l’objet éclairé.

→ Les images produites sont facilement numérisées et traitées par des logiciels.
→ Ceux-ci permettent : de compenser diverses erreurs optiques inhérentes au microscope ; d’agrandir numériquement l’image ; d’accentuer les contrastes.

→ Il est utilisé pour observer des cellules en culture dans des boîtes de Pétri.
→ L’objet est éclairé par-dessus.
→ L’objectif est situé en dessous de la platine et de la préparation.
→ Un tube porte-oculaire redresse les faisceaux lumineux afin que les oculaires soient placés à une hauteur adaptée à l’utilisateur.

→ Les cellules sont cultivées dans des boîtes ou des flasques.
→ Elles peuvent être observées au microscope inversé.
→ Elles sont maintenues dans une étuve.
→ Les manipulations sont réalisées dans des conditions stériles sous hotte à flux laminaire.

→ Ces systèmes exploitent les interférences lumineuses produites par les rayons traversant différents endroits présentant :
des indices de réfraction différents ; ou des épaisseurs différentes

les traceurs fluorescents ; l’expression de protéines chimères fluorescentes ; l’immunodétection ; l’hybridation in situ ; les indicateurs quantitatifs de concentrations ioniques.
→ Ces marquages peuvent notamment être observés par : microscopie à fluorescence ; microscopie confocale.

→ Une molécule fluorescente absorbe la lumière à une certaine longueur d’onde, appelée longueur d’onde d’excitation.
→ Elle réémet ensuite des photons : de plus faible énergie ; de longueur d’onde plus grande.

→ C’est un microscope optique muni : d’oculaires ; d’objectifs ; d’une lampe à vapeur de mercure.
→ Cette lampe produit un faisceau lumineux de forte puissance destiné à éclairer l’échantillon et à exciter les molécules fluorescentes.

→ La lampe est située latéralement.
→ L’éclairage de la préparation se fait par le dessus, d’où le terme épifluorescence.

→ La lumière réémise par l’échantillon repart en sens inverse.
→ Elle traverse : le miroir dichroïque ; un deuxième filtre d’arrêt.
→ Ce filtre sélectionne les photons spécifiques de la réémission, dont la longueur d’onde est plus élevée.

→ Les microscopes disposent généralement de trois types de cubes, permettant des acquisitions rouge, verte et bleue.
→ Cela permet notamment le triple marquage des échantillons biologiques.
→ D’autres combinaisons sont possibles grâce aux fluorochromes couvrant un spectre plus large d’émissions de fluorescence.

→ L’image obtenue correspond à un plan focalisé de l’échantillon.
→ Les parties situées de part et d’autre de ce plan sont également éclairées.
→ Elles provoquent un flou dû aux éléments hors plan.
→ Plus l’échantillon est épais, plus ce flou peut être important.

La lumière traverse un premier filtre, qui sélectionne les longueurs d’onde d’excitation du fluorochrome utilisé.
Le filtre se trouve dans un cube contenant également un miroir dichroïque.Le miroir dichroïque réfléchit le faisceau vers la platine.Les photons excitateurs ainsi sélectionnés arrivent sur l’échantillon et excitent le fluorochrome.

La lumière fournie par une lampe est concentrée sur l’objet par la lentille du condenseur. Le réglage du cône lumineux convergeant sur l’objet est une étape importante. L’échantillon est placé devant le premier groupe optique : l’objectif.
L’objectif forme une image réelle, renversée et plus grande que l’objet.

→ La qualité d’observation augmente lorsque l’objet est de faible épaisseur.
→ Mais préparer des coupes fines revient à observer des « tranches » de cellules, en perdant ce qui était situé au-dessus et au-dessous

→ Le microscope confocal utilise un laser comme source lumineuse.
→ La lumière est canalisée à travers une petite ouverture appelée pinhole, afin d’éclairer l’échantillon en un seul point.

→ La lumière réémise est canalisée par un deuxième pinhole.
→ Elle est récupérée par un détecteur photomultiplicateur.
→ La lumière provenant des points hors du plan de focalisation est exclue du détecteur.
→ Cela supprime du flou et du bruit de fond.

→ La résolution spatiale maximale est obtenue par l’ajustement du diamètre du pinhole à la limite de diffraction.

→ Un système motorisé permet un balayage du champ par le faisceau laser, dans le plan et dans l’épaisseur de l’échantillon.
→ Les données de chaque point sont recueillies de façon séquentielle selon une trame, puis envoyées sur un écran vidéo.
→ Le balayage est obtenu par modification de l’inclinaison d’un miroir dichroïque.

→ Plusieurs plans successifs sont balayés.
→ On obtient artificiellement l’équivalent de coupes optiques successives.
→ Elles permettent de reconstruire en 3D l’image d’un échantillon dont l’épaisseur peut atteindre 150 µm.

→ Le microscope confocal permet d’obtenir l’image d’un plan focal avec une définition bien supérieure à celle du microscope conventionnel.
→ L’élimination du bruit de fond entraîne : une très bonne sensibilité de détection ; une augmentation du contraste ; une clarification des images.

→ Elles ne modifient pas l’intégrité de l’échantillon biologique.
→ Elles s’opposent aux coupes physiques nécessaires en microscopie photonique et électronique.