UE1F mémo sur l imagerie des structures cellulaires

→ Elle augmente les possibilités :d’analyse ; de quantification ; de reconstruction d’images en 3D.

→ Les protéines fluorescentes et leurs gènes ont été isolés d’organismes vivants capables de produire de la fluorescence.
→ La GFP provient de la méduse Aequora victoria.
→ mCherry provient du corail Discosoma, commun dans l’océan Indien.

→ Le gène de la GFP est fusionné avec le gène de la protéine d’intérêt.
→ La construction est réalisée par clonage dans un plasmide, qui sert de vecteur.
→ Les séquences fusionnées sont placées sous le contrôle d’un promoteur choisi, afin de contrôler l’expression du gène hybride

→ La construction est introduite dans les cellules par transfection.
→ Le gène hybride devient un transgène.
→ Il entraîne l’expression d’une protéine chimère.
→ Sa localisation est facilitée grâce à sa fluorescence.

→ Le plasmide met en phase : la séquence du gène de l’histone H2B ; la séquence de l’EGFP.
→ Après transfection, le transgène entraîne l’expression d’une histone H2B verte.
→ La chromatine devient verte.

L’expression peut : être obtenue transitoirement dans des cellules en culture ; ou faire l’objet d’une transgénèse chez un animal.
Cela permet d’étudier : la spécificité d’expression tissulaire ; la distribution ; la dynamique de la protéine chimère dans l’organisme entier.

→ Non. Elle peut : être obtenue transitoirement dans des cellules en culture ; ou faire l’objet d’une transgénèse chez un animal.
→ Cela permet d’étudier la spécificité d’expression tissulaire, la distribution et la dynamique de la protéine chimère dans l’organisme entier.

→ Les anticorps peuvent être conjugués :

• à des marqueurs fluorescents, permettant la fluorescence ;
• à des enzymes donnant un produit détectable par colorimétrie, bioluminescence ou chimiluminescence ;
• ou à d’autres systèmes de marquage présentés dans le cours.

→ Le cytosquelette est constitué de différents filaments de très petit diamètre.
→ L’immunodétection permet notamment de révéler : la tubuline ; la vimentine ; la protéine GFAP, constitutive de filaments dits intermédiaires.
→ Ces marquages montrent que le cytoplasme est traversé par des réseaux de câbles structurant la forme des cellules.

→ Elle permet de suivre ce que les cellules synthétisent et produisent en fonction des circonstances.
→ Exemple du cours : chez des fibroblastes soumis à un stress, on peut détecter la présence et la sublocalisation cellulaire de l’interleukine 6, représentée en rouge.
→ Cette cytokine constitue un message d’alerte pour l’organisme associé à l’inflammation aiguë.

→ Elle permet de suivre l’apparition et la distribution spatiale de plusieurs facteurs clés du développement embryonnaire.
→ Dans les embryons de drosophile présentés dans le cours, on observe : la répartition segmentée de produits de gènes contrôlant la polarité segmentaire ; la mise en place de gradients morphogénétiques.

→ Le stade de cellularisation de l’embryon, avec la mise en évidence des membranes cloisonnant chaque noyau, peut être suivi grâce à cette technique d’immunodétection.

• Un disque opaque bloque la lumière directe.
• L’échantillon est éclairé latéralement.
• Seule la lumière diffusée est collectée.
• L’objet apparaît brillant sur fond noir.
• Intérêt : augmenter le contraste des échantillons transparents non colorés

• Intercalant de l’ADN.
• Absorbe dans les UV.
• Émet une fluorescence bleue brillante.

• HIS/ISH = hybridation in situ.
• FISH = hybridation in situ utilisant une sonde fluorescente.
• Une sonde oligonucléotidique complémentaire permet de repérer une séquence spécifique d’ADN ou d’ARN dans l’échantillon.

• Repérer des séquences d’ADN ou d’ARN.
• Suivre la réplication et la distribution d’un génome viral.
• Étudier l’expression d’un gène en visualisant ses transcrits ARN.
• Détecter simultanément, par exemple, un ARN ribosomal et un ARNm.

Les variations de H⁺, Na⁺, K⁺, Cl⁻ et Ca²⁺ participent notamment :

• à la production d’énergie ;
• aux transports vésiculaires ;
• à la communication cellulaire ;
• aux propriétés électriques des membranes.

• Protéine luminescente d’Aequorea victoria.
• Possède 3 sites de liaison au Ca²⁺.
• La fixation du Ca²⁺ en présence d’O₂ entraîne un changement de conformation.
• Elle émet alors un photon à 470 nm.
• Elle ne nécessite donc pas d’excitation lumineuse.

• L’aequorine émet un photon à 470 nm.
• Ce photon excite la GFP.
• La GFP réémet autour de 509 nm → fluorescence verte.

• Elle peut être microinjectée dans l’ovocyte.
• La vague de Ca²⁺ commence au point d’entrée du spermatozoïde.
• Elle se propage ensuite à travers l’œuf.
• Limite : l’aequorine émet peu de photons.

• Fura-2 est un indicateur fluorescent sensible au Ca²⁺.
• Sa fluorescence diffère selon qu’elle a fixé ou non le Ca²⁺.
• Le rapport des intensités de fluorescence permet de déterminer précisément la concentration en Ca²⁺.

Concentration croissante :
bleu → vert → jaune → rouge
Il existe aussi des indicateurs fluorescents permettant de mesurer d’autres ions intracellulaires.

• MET/TEM = microscopie électronique à transmission.
• Utilise un faisceau d’électrons.
• Les lentilles sont des bobines électromagnétiques.
• Permet l’étude des ultrastructures cellulaires.
• Pouvoir séparateur maximal indiqué : environ 0,1 nm = 1 Å.
• Grossissement : de l’ordre de ×1 000 000.

• ↑ voltage → ↓ longueur d’onde des électrons → meilleure résolution théorique.
• La résolution réelle est limitée par les aberrations des lentilles électromagnétiques.

• Le MET récupère les électrons transmis à travers l’échantillon.
• Zones claires = électrons ayant traversé l’échantillon.
• Zones sombres = électrons diffusés.
• L’image obtenue est initialement en noir et blanc.

• Aldéhydes : permettent des liaisons covalentes croisées.
• Tétroxyde d’osmium : réagit avec les liaisons C=C et fixe notamment les lipides membranaires.

• L’échantillon est déshydraté.
• La paraffine n’est pas assez dure.
• On utilise des résines comme Epon ou Araldite.
• Leur polymérisation produit un bloc très dur.

• Elles doivent faire moins de 100 nm, souvent environ 50 nm.
• Elles sont réalisées avec un ultramicrotome.
• Elles sont recueillies sur des grilles de cuivre.
• Cette finesse est nécessaire car les électrons ont un pouvoir de pénétration limité.

R : Les structures ayant diffusé les électrons grâce aux dépôts métalliques apparaissent noires ou grisées sur un fond plus clair.

R : Le dépôt métallique opaque aux électrons se forme essentiellement autour de l’objet.
→ Objet clair sur fond sombre, donnant l’impression d’un négatif.

R : L’objet est recouvert de métal par vaporisation afin de révéler son relief.

• le métal s’accumule sur le côté exposé ;
• l’autre côté est protégé ;
• cela produit un effet d’ombre portée révélant le relief.

• Incidente → projection selon un angle déterminé → effet d’ombre. effet de relief
• Rotative → dépôt plus uniforme recouvrant l’ensemble de l’objet.

R : Des molécules et macromolécules isolées, notamment des acides nucléiques, avec possibilité d’observer des figures de réplication ou de transcription.

• Fréon : environ −100 °C.
• Azote liquide : environ −192 °C.

R : Il est frappé à l’aide de la lame refroidie d’un microtome. Le bloc se sépare selon les lignes de plus faible résistance.

R : Entre les deux feuillets lipidiques, donc au centre de la bicouche.

R : Après la fracture, la préparation est légèrement réchauffée afin de provoquer une sublimation de l’eau et un creusement des reliefs.
→ Cette étape est facultative.

R : Une réplique du plan de fracture, et non simplement une surface externe de l’échantillon.

La séparation arrache les complexes protéiques traversant la membrane :

• certaines protéines restent enchâssées dans un feuillet → bosses/granules ;
• leur arrachement peut laisser des trous sur l’autre.

• Face E → réplique interne du feuillet extracellulaire.
• Face P → réplique interne du feuillet cytoplasmique.

Les protéines transmembranaires ne restent pas nécessairement réparties de la même manière entre les deux feuillets après leur séparation.
→ Les deux faces possèdent donc des caractéristiques propres de bosses et de trous.

R : Le cryo-MEB est un MEB équipé d’un système refroidissant, permettant l’observation d’un échantillon cryopréparé (fixé et congelé).

• électrons secondaires = SE ;
• électrons rétrodiffusés = BSE (backscattered electrons).

• MET → électrons transmis à travers l’échantillon.
• MEB/SEM → électrons diffusés, ayant rebondi ou émis à partir de la surface de l’échantillon.

R : L’échantillon peut être fixé ou congelé, puis sa surface est recouverte de métal par vaporisation métallique.

R : Parce que c’est essentiellement sa surface qui est balayée par les électrons.

R : Des objets relativement épais ou entiers peuvent être étudiés, par exemple une partie entière de végétal ou de petits animaux comme des insectes.

R : Un étroit faisceau d’électrons balaye la surface de l’échantillon. Les électrons provenant de chaque point balayé sont récupérés pour former l’image.

R :

• MEB → surface.
• DIC → observation en microscopie optique.
• MET après coupe et contraste positif → ultrastructure interne.

R : Elle fournit la preuve directe que les protéines de la membrane plasmique sont mobiles dans le plan de la membrane.

R : On fusionne deux cellules dont les protéines membranaires sont marquées différemment, puis on observe leur redistribution dans la membrane de la cellule hybride.

R : Récupération de fluorescence après photoblanchiment.

R : Par un fluorochrome (avec un anticorps marqué) ou par une protéine de fusion avec GFP.

R : Une petite zone fluorescente est blanchie avec un laser, puis on observe la récupération de la fluorescence dans cette zone.

R : Les molécules blanchies sortent par diffusion de la zone irradiée et les molécules non blanchies y entrent par diffusion.

R : Perte de fluorescence après photoblanchiment.

R : Une petite zone de membrane est irradiée en continu, tandis que la fluorescence est mesurée dans une autre zone.

R : Les protéines fluorescentes sortent par diffusion de cette zone et les molécules blanchies y entrent.

R : À la fin, toutes les molécules fluorescentes sont blanchies.

R : Inverse FRAP.

R : Au lieu de blanchir une seule zone, on blanchit toute la surface et on conserve une zone fluorescente.

Réponse : L’aequorine émet une faible quantité de photons en réponse au Ca²⁺. La sonde Fura-2 est plus sensible et permet de suivre des variations fines de la concentration intracellulaire en Ca²⁺.

Contraste positif : les métaux lourds se déposent sur les structures → elles apparaissent plus ou moins sombres, avec différentes nuances de gris.

• Contraste négatif : le fond est contrasté → les structures apparaissent claires sur un fond sombre.

Réponse : C’est une microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) qui augmente le contraste des structures transparentes et leur donne un aspect de pseudo-relief (fausse 3D).

: C’est une variante du MEB où l’échantillon est coupé ou fracturé en série, ce qui permet de révéler et d’explorer les éléments internes de l’échantillon.

Réponse : Une protéine intrinsèque est insérée dans la bicouche lipidique. Une protéine extrinsèque est associée à la surface de la membrane, côté intra- ou extracellulaire.