Techniques histologiques et préparation des échantillons

Techniques Histologiques : Guide Essentiel

L'histologie, la «science des tissus», implique l'observation et l'interprétation. Elle se déroule en 4 étapes clés : choix du matériel, choix de la technique, production des images et interprétation.

I. Méthodes d'Observation

A. Pouvoir Séparateur des Instruments

• Œil humain normal : 200

• Microscope Optique (MO) : grossissement , pouvoir séparateur 0,2 ou 200 nm

• Microscope Électronique (ME) : grossissement , pouvoir séparateur 0,2 nm

B. Avantages et Contraintes de la Microscopie Électronique

• Utilisation d'un faisceau d'électrons.

• Observation des structures cellulaires à l'échelon ultrastructural.

• Importantes contraintes techniques et indications spéciales.

II. Choix du Matériel et Modalités de Prélèvement

Le choix du matériel est crucial pour la qualité de l'analyse.

• Biopsies : Directes ou par voie endoscopique (ex: biopsie de peau, muqueuse digestive).

• Pièces opératoires (ex: ablation de la thyroïde).

• Autopsies.

• Frottis (ex: frottis de la muqueuse linguale).

• Ponctions à l’aiguille (ex: ponction de liquide céphalo-rachidien).

• Liquides spontanément émis (ex: urine).

III. Procédures Techniques Générales (Microscopie Optique)

Les coupes examinées sont le résultat de plusieurs étapes successives.

A. Fixation

• But : Conserver les structures cellulaires dans un état proche de la vie.

• Quand : Immédiatement après le prélèvement.

• Méthodes :

  • Immersion :

    • Formaldéhyde (formol) +++

    • Alcools (éthanol)

    • Mélanges fixateurs (ex: liquide de BOUIN: Eau, Formol, acide acétique, Acide Picrique).

  • Congélation : à -20°C (cas particuliers).

  • Séchage à l'air (ex: frottis sanguin).

• Recoupe des échantillons tissulaires fixés pour le choix des prélèvements.

B. Inclusion

• But : Durcir le prélèvement pour réaliser des coupes fines (5 à 7 ).

• Milieu d'inclusion : Généralement la paraffine.

  • Liquide à , solide à .

  • Hydrophobe, soluble dans le xylène.

• Étapes avant l'inclusion :

  1. Déshydratation : Bains d'alcool de concentration croissante (50° à 100°).

  2. Passage dans un solvant : Bains de xylène (pour homogénéisation).

  3. Immersion : Dans de la paraffine liquide ( pendant plusieurs heures).

  4. Inclusion et refroidissement : Pour former un bloc de paraffine durcie.

C. Coupe

• Réalisation de coupes de 5 à 7 d'épaisseur.

• Outil : Microtome muni d'un rasoir.

• Les coupes (en « rubans ») sont étalées et collées sur des lames de verre avec de l'albumine glycérinée.

D. Coloration

• Intérêt : Accentuation des contrastes par fixation sélective de colorants.

• Colorants : Sels en solution aqueuse.

• Étapes avant coloration :

  1. Déparaffinage : Chaleur et bains de xylène.

  2. Réhydratation : Bains d'alcool de concentration décroissante (100° à 50°).

• Types de Colorations :

  • De routine :

    • Hémalun-Éosine (HE) :

      • Hémalun (basique, bleu-violet) : Affinité pour les acides nucléiques (noyaux basophiles).

      • Éosine (acide, rose) : Affinité pour les protéines cytoplasmiques (cytoplasme acidophile/éosinophile).

    • Trichrome de Masson (violet pour noyau, rouge pour cytoplasme, bleu vif pour fibres collagènes).

  • Spécifiques :

    • Orcéine : Met en évidence les fibres élastiques (brun).

    • Imprégnation argentique : Met en évidence les fibres de réticuline (brun).

• Métachromasie : Capacité d'un colorant à changer de teinte (ex: Bleu de Toluidine colore en rose-fuschia les GAG). L'orthochromasie est une teinte identique.

E. Montage

• Intérêt : Protection de la coupe par une lamelle de verre.

• Collage : Avec une résine synthétique aux propriétés de la paraffine.

• Étapes avant montage :

  • Déshydratation : Bains d'alcool de concentration croissante.

  • Passage dans un solvant : Bains de xylène.

• Conduit à l'Observation au microscope.

IV. Techniques Histochimiques et Immuno-histochimiques

A. But

Mettre en évidence et localiser des composants biochimiques (histochimie) ou des antigènes (immunohistochimie) dans une cellule.

B. Exemples

• Glycogène et GAG : Réaction du PAS (Periodic Acid Schiff) → précipité rose fuschia.

• Lipides :

  • Les lipides sont dissous par les solvants habituels (xylène, alcool).

  • Pour les conserver: Congélation à -20°C puis colorations électives (Rouge Soudan, Noir Soudan).

• Antigènes : Immunohistochimie (utilisation d'anticorps spécifiques).

V. Techniques en Microscopie Électronique

Des contraintes techniques spécifiques sont nécessaires pour observer l'ultrastructure.

A. Fixation

• Prélèvement de petite taille ().

• Double fixation :

  1. Glutaraldéhyde ou paraformaldéhyde.

  2. Post-fixation dans le Tétroxyde d'Osmium (acide osmique) pour préserver les membranes.

• Fixation à pour éviter l'autolyse, durée adaptée au tissu.

• Les fixateurs MO sont inutilisables en ME.

B. Inclusion

• Utilisation de résines (propriétés similaires à la paraffine).

• Solvant : Oxyde de propylène.

• Étapes : Déshydratation (alcools croissants), bain de solvant, enrobage en résine.

C. Coupe

• Outil : Ultramicrotome avec éclat de verre ou de diamant.

• Coupes ultrafines de 50 nm (100 fois plus fines qu'en MO).

• Recueil des coupes sur une grille porte-objet.

D. « Coloration » (Contrastation)

• Utilisation de sels de métaux lourds (Acétate d'uranyle, Citrate de Plomb).

• Pas d'élimination de la résine ni de réhydratation.

• Les sels se déposent et créent des contrastes par diffraction du faisceau d'électrons.

  • Acétate d'uranyle → noyau, nucléole, ribosomes (densité élevée aux e-).

  • Citrate de Plomb → membranes (plasmique et organites cytoplasmiques).