Techniques histologiques 2 fondamentales en pathologie

De la Lame Blanche au Diagnostic en Histopathologie

Ce document détaille les étapes techniques essentielles pour transformer une lame histologique «blanche» (non colorée) en une lame diagnostique, en se concentrant sur les techniques de coloration, de montage et d'autres méthodes appliquées en pathologie humaine.

1. Le Parcours de la Lame Blanche à la Lame HES

Le processus général pour préparer une lame à partir d'un échantillon tissulaire paraffiné suit une séquence précise pour permettre l'observation microscopique :

1. Déparaffinage: Élimination de la paraffine du tissu.

2. Réhydratation: Rétablissement de l'eau dans le tissu.

3. Coloration: Application de colorants pour visualiser les structures.

4. Déshydratation: Élimination de l'eau avant le montage.

5. Montage: Fixation de la coupe tissulaire sur la lame avec une lamelle et un milieu de montage.

6. Lame HES: Lame prête pour l'analyse diagnostique, souvent colorée à l'Hématoxyline-Éosine-Safran (HES).

2. Concepts Clés en Coloration Histologique

La compréhension des termes suivants est fondamentale pour les techniques de coloration :

• Colorant: Une substance (naturelle ou synthétique) en solution qui réagit chimiquement avec le tissu pour le teindre.

• Mordant: Un sel métallique qui se fixe au tissu et agit comme un "pont" chimique pour augmenter l'adhérence du colorant au substrat.

• Laque: La combinaison (soluble ou non) d'un colorant avec un mordant.

2.1 La Différenciation

La différenciation est l'élimination sélective de l'excès de colorant fixé au tissu, dans le but d'accentuer la spécificité de la coloration. Elle se distingue de la décoloration, qui est un processus non sélectif.

Elle peut être réalisée par :

• Des solvants.

• Une variation de pH.

• Des mordants.

• Des oxydants.

Attention : La différenciation est différente du bleuissement de l'hématoxyline.

2.2 Principes de Fixation des Colorants

Les colorants se fixent aux tissus par diverses forces :

• Laques basiques (cations +) se fixent sur les structures basophiles (anions -), comme les phosphates des acides nucléiques et les glycosaminoglycanes sulfatés (par exemple, Hématoxyline).

• Colorants acides (anions -) se fixent sur les structures acidophiles (cations +), comme les protéines cytoplasmiques (par exemple, Éosine).

• Autres mécanismes de fixation incluent les forces de Van der Waals, les liaisons hydrogènes et les liaisons covalentes (comme dans les colorations PAS et Feulgen).

3. Les Colorations Standard (Signalétiques)

Ces colorations, souvent appelées "signalétiques" ou "trichromes", mettent en évidence la micro-anatomie cellulaire basée sur les différences d'affinités tinctoriales.

3.1 Colorations en Histologie

• HES (Hématoxyline-Éosine-Safran) / HPS (Hématoxyline-Phloxine-Safran):
  La coloration HES est la technique de base en histologie, utilisant trois colorants successifs :

  • Un colorant nucléaire (bleu/violet) : Hématoxyline ou Hémalun.

  • Un colorant cytoplasmique (rose) : Éosine Y, Érythrosine, ou Phloxine.

  • Un colorant du collagène (jaune-orange) : Safran.

  Résultats typiques de l'HES :
  - Noyaux : bleu-violet
  - Cytoplasme : rose
  - Conjonctif : vert (pour certaines variations) ou jaune-orange (pour le safran)

• Trichrome de Masson:
  

  Résultats typiques :
  - Noyaux : bleu-violet
  - Cytoplasme : rose
  - Conjonctif : bleu

• Azan:
  

  Résultats typiques :
  - Noyaux : rouges
  - Hématies : jaune-orangé
  - Conjonctif : bleu

3.2 Colorations en Cytologie

• Coloration de Papanicolaou: Utilisée pour les frottis fixés, notamment en gynécologie.
  

  Figure majeure : Georgios Nicholas Papanicolaou (1883-1962), pionnier dans la valeur diagnostique des frottis vaginaux.

• May Grünwald Giemsa (MGG): Utilisée pour les lames sèches, notamment en hématologie.
  

  Le colorant de Giemsa est un mélange d'azur de méthylène et d'éosine, dont la principale difficulté réside dans le dosage de l'étape de différenciation.

  Résultats typiques :
  - Noyau : bleu-violet
  - Cytoplasme : rose
  - Conjonctif : orange

4. Détails des Principaux Colorants

4.1 L'Hématoxyline

• Colorant naturel ancien, découvert avec l'Amérique, extrait du bois de Campêche (Hematoxylon campechianum).

• Introduit en histologie par Waldeyer en 1863.

• Utilisé sous forme de laques métalliques.

• Composition : Il faut de l'hématoxyline (le "colorant"), un oxydant (pour l'oxyder en hématéine), un mordant (aluminium ou fer pour former la laque) et d'autres composants (glycérol, acide) pour éviter une oxydation secondaire.

• Propriétés : Colore les substances basophiles (noyaux) en milieu aqueux. Initialement rouge, elle devient bleu-noir ou bleu-pourpre après bleuissement.

• Bleuissement : Réalisé avec des solutions alcalines (eau du robinet, carbonate de lithium, eau ammoniacale, tampons Scott).

• Modes de Coloration :

  • Progressive : Juste le temps nécessaire pour obtenir la coloration voulue.

  • Régressive : Sur-coloration excessive, suivie d'une différenciation (élimination sélective de l'excès de colorant) avec de l'eau acidifiée ou de l'éthanol acidifié (ex: HCl 0,05% dans éthanol 70°).

4.2 L'Éosine

• Dérivés de la fluorescéine (1871). Les principaux sont l'Éosine Y, l'Érythrosine B et la Phloxine B.

• Colorants acides qui teignent les substances acidophiles (cytoplasme) en rose.

• Utilisée en solution aqueuse ou alcoolique.

4.3 Le Safran

• Colorant naturel extrait du Crocus sativus, introduit par Masson en 1911.

• Colore le collagène en jaune-orange.

• Colorant alcoolique, appliqué en dernier dans la coloration.

• Extrêmement sensible et facilement éliminé par des alcools faibles, ce qui nécessite une attention particulière à l'hydratation des alcools de rinçage.

5. Automatisation des Colorations

Les étapes de déparaffinage, réhydratation, coloration (par exemple HPS), déshydratation finale et parfois même le montage sont souvent automatisées par des appareils de type carrousel ou linéaire.

6. Le Montage des Lames Histologiques

Le montage est crucial pour protéger la coupe colorée, favoriser sa conservation et son observation microscopique en résolvant les problèmes d'indice de réfraction.

• Peut être automatisé ou manuel.

• Utilise des lamelles couvre-objet (verre, plastique) et un milieu de montage.

• Milieux de montage :

  • Hydrosolubles : Utilisés notamment pour l'immunohistochimie (colles polyvinyliques).

  • Résines naturelles ou synthétiques : Baume du Canada, Eukitt®, Entellan®, Pertex®. Nécessitent une déshydratation préalable si la coupe a été colorée en milieu aqueux.

• Le travail doit être effectué sous hotte.

7. Colorations Spéciales (Histochimie et Affinités Tinctoriales)

Ces colorations visent à mettre en évidence des constituants spécifiques, endogènes (sucres, mucines, lipides, acides nucléiques, pigments) ou exogènes (bactéries, champignons).

7.1 Détection des Glucides et Mucines

• Coloration PAS (Periodic Acid-Schiff) :

  • Met en évidence les glycoprotéines des épithéliums et membranes basales, ainsi que le glycogène (foie, muscle).

  • L'acide périodique oxyde modérément les glucides en aldéhydes, qui réagissent ensuite avec le réactif de Schiff pour produire une coloration.

  • Contre-coloration : Hématoxyline ou Hémalun.

• Coloration Bleu Alcian (Steedman 1950, Luna 1968) :

  • Phtalocyanine cuivrique hydrosoluble.

  • À pH 2.5 (milieu acide), il colore les mucopolysaccharides sulfatés acides, carboxylés et les glycoprotéines (sialomucines).

  • À pH 1.0 (milieu plus acide), il ne colore plus les mucopolysaccharides carboxylés.

  • Contre-coloration : Rouge nucléaire.

  • La fixation à pH acide (ex: acide acétique 3%) permet au bleu alcian de se fixer aux groupements acides des mucopolysaccharides carboxylés.

• Coloration combinée PAS/Bleu Alcian.

7.2 Détection des Fibres (Réticuline, etc.)

• Imprégnations Argentiques :

  • Basées sur la réduction de sels d'argent en argent métallique se déposant sur les structures.

  • Elles sont stables, sensibles, contrastées mais capricieuses (ph alcalin, décollements, réactions non spécifiques).

  • Exemples : Réticuline (Gomori), Grimelius, Grocott (champignons).

  • Gomori-Grocott : Les glucides des parois des champignons sont oxydés en aldéhydes par l'acide chromique, qui réduit ensuite le complexe argent/méthénamine en précipité métallique noir. Contre-coloration : vert lumière.

  • Réticuline (Gomori) : Après sensibilisation, les fibres de réticuline (argyrophiles) fixent le nitrate d'argent ammoniacal. Le sel d'argent est réduit par le formol en précipité noir. Contre-coloration: hématoxyline ou rouge nucléaire.

• Rouge Sirius :

  • Le rouge Sirius en solution saturée d'acide picrique se fixe sur les fibres de réticuline et de collagène.

  • Absence de contre-coloration.

7.3 Détection des Pigments et Minéraux

• Mélanine : Se fixe et réduit les sels d'argent (argentaffines) pour former un précipité d'argent métallique noir. Contre-coloration : rouge nucléaire.

• Perls (Fer) (Max Perls 1843-1881) :

  • Le fer de l'hémosidérine (Fe+++) forme un précipité de ferrocyanure ferrique (réaction du bleu de Prusse) avec le ferrocyanure de potassium en milieu acide.

  • Contre-coloration : rouge nucléaire.

7.4 Détection des Bactéries et Agents Infectieux

• Ziehl-Neelsen (Franz Ziehl 1859-1926 & Friedrich Neelsen 1854-1898) :

  • Coloration spécifique des bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR).

  • Une fuschine basique et du phénol colorent les bactéries. Seuls les BAAR retiennent la coloration après différenciation à l'alcool-acide.

  • Contre-coloration : bleu de méthylène.

  • Note : Pas de réhydratation, déparaffinage dans un mélange xylène/huile de paraffine.

7.5 Détection de l'Amyloïde

• Rouge Congo :

  • Colore la substance amyloïde en rouge saumon en lumière transmise.

  • Présente une biréfringence vert-jaune en lumière polarisée (nécessite des coupes épaisses de 8µm et une forte intensité lumineuse).

7.6 Détection des Lipides

• Les lipides résistent mal à la fixation et aux solvants, donc souvent recherchés sur coupes à congélation.

• Exemples : Oil Red O, Noir Soudan, Bleu de Nil.

7.7 Quantification de l'ADN

• Coloration de Feulgen :

  • Utilisée pour quantifier l'ADN, l'intensité de coloration étant proportionnelle à la quantité d'ADN.

  • Nécessite une fixation MFA ou Carnoy.

  • Procédé : Hydrolyse acide de l'ADN (HCl) pour couper les liaisons purine-désoxyribose, puis révélation des aldéhydes par le réactif de Schiff (rouge) ou acide 2-hydroxy-3-naphtoïque + fast blue (bleu).

  • Les cytoplasmes sont digérés et donc invisibles, les noyaux apparaissent rouges ou bleus.

  • Analyse d'image pour déterminer la ploïdie (normalisation avec un témoin 2n).

7.8 Détection d'Enzymes (Histochimie Enzymatique)

• Utilisée pour détecter les enzymes et les constituants labiles, principalement sur les biopsies et coupes à congélation avec fixation contrôlée.

• Domaines d'application : Pathologie musculaire.

• Exemples : Adénosine Triphosphatase (ATPase) pour distinguer les fibres musculaires de type 1 et 2, phosphorylase.

8. Immunohistochimie (IHC)

L'immunohistochimie utilise des anticorps pour identifier des cibles spécifiques (souvent protéiques ou glycoprotéiques) dans les tissus.

• Objectifs :

  • Immuno-phénotypage des lésions (étiquetage précis).

  • Recherche de micro-métastases ou maladie résiduelle.

  • Mise en évidence de facteurs pronostiques.

  • Recherche d'agents infectieux.

• Principes :

  • Mettre en évidence une cible (Antigène) avec des anticorps spécifiques.

  • Détecter in situ la fixation de l'anticorps à l'aide d'un marqueur (enzyme + chromogène ou fluorochrome), souvent après des étapes d'amplification (multicouches, avidine-biotine, tyramine).

9. Sécurité et Élimination des Déchets

9.1 Risques Laboratoires

• Biologiques : Coupures, piqûres, projections lors de la manipulation des prélèvements.

• Chimiques : Exposition aux fixateurs et réactifs.

• Cryogéniques : Gaz d'azote liquide, carboglace.

• Incendie : Solvants, paraffine.

9.2 Élimination des Pièces Anatomiques

L'élimination des pièces opératoires reconnaissables est régie par des arrêtés spécifiques, notamment l'Arrêté du 7 septembre 1999 relatif aux modalités d'entreposage et au contrôle des filières d'élimination des déchets d'activités de soins à risques infectieux et assimilés et des pièces anatomiques.

10. Archivage Légal

L'archivage des blocs d'inclusion, des lames et des comptes-rendus est une obligation légale, encadrée par les Recommandations de Bonnes Pratiques en Anatomie et Cytologie Pathologiques (RBPACP) de 1998.

Conclusion

Le cheminement de la lame blanche au diagnostic est un processus rigoureux et multi-étapes, essentiel à la pathologie humaine. Il implique une excellente maîtrise des techniques de coloration standard et spéciales, de l'immunohistochimie, et une conscience aiguë des protocoles de sécurité et d'archivage. Ces techniques permettent une observation détaillée des tissus, indispensable pour le diagnostic de diverses pathologies.