Techniques d’étude des cellules et des tissus

• Examen vital : cellules observées vivantes dans l’organisme, sans prélèvement.
• Examen supra-vital : cellules tout juste prélevées, encore vivantes ; exemples : urine et sperme à l’état frais.
• Examen après fixation : cellules tuées et fixées pour préserver au mieux leur morphologie et leur composition ; exemples : frottis sanguin et vaginal.

Plus on s’éloigne du vivant, plus on gagne en détails et plus on perd l’information dynamique.

1. Recueillir l’urine fraîche dans un récipient propre.
2. Concentrer les éléments par sédimentation ou, de préférence, centrifugation : on récupère le culot.
3. Déposer une goutte du culot sur une lame et la couvrir d’une lamelle.
4. Observer au microscope photonique, à l’objectif à sec, sans coloration.
   La concentration rend plus dense la population cellulaire à étudier. L’urine doit être fraîche et recueillie proprement pour éviter l’altération des cellules et parasites et la prolifération de bactéries contaminantes.

Sédimentation ou centrifugation ? La sédimentation laisse déposer les éléments par gravité : elle est lente et la concentration obtenue est modeste. La centrifugation accélère le dépôt par la force centrifuge : elle est rapide et plus efficace. L’examen fournit des renseignements morphologiques et dynamiques, notamment sur la forme et la mobilité de Trichomonas vaginalis ou des spermatozoïdes.

Fixer, colorer, monter, observer

1. Prélever les cellules (sang, col utérin) et étaler le prélèvement en couche mince sur une lame.
2. Fixer immédiatement : par la chaleur ou le froid, par un liquide fixateur (mélange alcool-éther à parts égales), ou par spray-cyte.
3. Colorer : bleu de méthylène, Giemsa ou Papanicolaou pour le frottis vaginal.
4. Coller une lamelle avec de l’Eukitt ou du baume du Canada.
5. Observer au faible puis au fort grossissement, éventuellement à l’immersion.

⚠️ Piège : un frottis fixé trop tard sèche à l’air et devient ininterprétable ; il faut le fixer dès l’étalement.

Une inclusion donne au tissu mou la consistance solide nécessaire à une coupe fine. Les coupes à la paraffine mesurent environ 7 µm et sont obtenues au microtome ; les coupes semi-fines à l’Épon mesurent 0,2–0,5 µm et sont obtenues à l’ultramicrotome.

Sept étapes systématisées

1. Prélèvement.
2. Fixation.
3. Inclusion.
4. Confection des coupes.
5. Étalement sur lame.
6. Coloration.
7. Montage.

Le prélèvement et la fixation Le prélèvement se fait si possible sur le vivant (biopsie), sinon le plus tôt possible après la mort ; il porte sur une partie ou la totalité d’un organe. Taille initiale : 5–10 mm. La fixation, temps le plus important, immobilise les cellules en préservant leur structure, insolubilise les constituants à étudier, durcit le tissu et le protège de l’autolyse et des bactéries. Elle est physique ou chimique, parfois par mélange de fixateurs ; sa durée va de quelques minutes à quelques heures selon le fixateur et la taille du fragment.

Principaux fixateurs chimiques

L’inclusion en paraffine Elle comporte la déshydratation en alcools de concentration croissante (5–10 min par bain), la substitution de l’alcool par le toluène, l’imprégnation par la paraffine fondue et la mise en bloc dans un moule (barres de Leuckart ou cassettes). L’eau est incompatible avec la paraffine.

Confection et étalement des coupes Tailler le bloc au ras de l’échantillon, puis débiter au microtome des rubans transparents d’environ 7 µm et les prélever au pinceau. Déposer les coupes par leur face brillante sur une lame dégraissée, enduite d’albumine glycérinée de Mayer et recouverte d’eau distillée ; une platine chauffante, sous le point de fusion de la paraffine, les fait adhérer.

La coloration : déparaffiner avant de colorer Fondre et dissoudre la paraffine (chaleur, toluène), réhydrater par des alcools décroissants (100°, 95°, 70°), colorer en solution le plus souvent aqueuse, puis déshydrater par des alcools croissants et du toluène avant le montage. La paraffine n’étant pas miscible à l’eau, elle empêcherait les colorants aqueux d’atteindre le tissu.

Les principaux colorants histologiques

La coloration de routine HPS (Hématoxyline–Phloxine–Safran) donne des noyaux bleus, des cytoplasmes rouges et du collagène jaune orangé.

Colorer pour identifier une substance

Les lipides sont dissous par les solvants de la paraffine : les étudier sur coupes à congélation (cryostat).

Le montage : conserver la préparation Déshydrater la lame colorée par des alcools croissants puis du toluène ; poser une mince couche de baume du Canada ou d’Eukitt, puis la lamelle. Le montage conserve durablement des coupes prêtes à l’observation.

Les 7 règles de la méthode « après fixation »

1. Éviter l’autolyse : prélever et fixer tôt après la mort, sinon réfrigérer.
2. Éviter les traumatismes : préférer une lame de rasoir aux pinces, couteaux et ciseaux.
3. Éviter la dessiccation : manipuler en milieu humide avant fixation.
4. Laver au soluté physiologique, pas à l’eau, qui fait gonfler les tissus.
5. Préparer des fragments minces : tranches de 1 cm ; après 1–2 h, recouper à 3–6 mm, voire 2–3 mm.
6. Faciliter la pénétration du fixateur dans les organes ou tissus.
7. Règle majeure : utiliser un volume suffisant de fixateur.

$V_{\text{fixateur}}$ est le volume du fixateur ; $V_{\text{fragment}}$ est le volume du fragment.

⚠️ Piège : ne pas confondre alcools croissants avant l’inclusion et avant le montage avec les alcools décroissants après déparaffinage, avant la coloration.

Fixer comme pour le microscope électronique : glutaraldéhyde puis tétroxyde d’osmium. Déshydrater et inclure dans la résine époxy Épon, très dure ; couper à l’ultramicrotome mécanique ou automatique. Étalées sur lame d’histologie et colorées, les coupes semi-fines s’observent au microscope optique. Elles donnent de meilleurs détails que les coupes à la paraffine et peuvent repérer une zone avant les coupes ultrafines pour le microscope électronique.

⚠️ Piège : ne pas confondre les coupes semi-fines d’Épon observées au MO et les coupes ultrafines destinées au ME.

Comparer l’état frais et le frottis après fixation

1. Définir examen supra-vital et examen après fixation.
2. Comparer état des cellules, préparation, coloration, renseignements et conservation.
3. Donner les exemples : urine et sperme ; frottis sanguin et vaginal.

Décrire une préparation histologique à la paraffine

1. Énumérer les sept étapes.
2. Détailler prélèvement et fixation, puis choix du fixateur selon les constituants à étudier.
3. Décrire inclusion, coupe, étalement, coloration et montage.
4. Rappeler l’épaisseur moyenne : ≈ 7 µm.

Comparer paraffine et Épon

1. Comparer milieu d’inclusion, appareil et épaisseur des coupes.
2. Préciser le mode d’observation : MO pour la paraffine et les semi-fines ; ME pour les ultrafines.
3. Donner les usages et la meilleure précision des détails avec l’Épon.