Principes et Types de Chromatographie

La chromatographie est une technique de séparation fondamentale, initiée en 1903 par Mikhail Tswett pour séparer des pigments végétaux sur une colonne de .

Principes Fondamentaux de la Chromatographie

Définition et Historique

• Chromatographie : Du grec khrôma (couleur) et graphein (écrire). Technique de séparation basée sur l'affinité différentielle de composés pour deux phases immiscibles.
• Chronologie clés:
  • 1903 : M.S. Tswett (première séparation sur colonne de pigments végétaux).
  • 1938 : N.A. Izmailov & M.S. Schraiber (CCM), H. Urey & T. Taylor (échange d'ions).
  • 1941 : A. Martin & R. Synge (chromatographie de partage sur papier).
  • 1944 : Erika Cremer (CPG).
  • 1951 : A. James & A. Martin (CPG).
  • 1966 : Giddings, Kirkland & Horvath (HPLC).

Concepts Clés

• Phase stationnaire () : Support fixe (solide ou liquide)qui retient les molécules (ex: de Tswett, silice, polymères).
  • Propriétés : Plus ou moins poreux (particules de 1 à 45 m), recouvert ou non d'un liquide.
  • Silice () : Support de base, polaire par ses groupements silanols. Peut être vierge ou greffée (chaînes alkyles apolaires comme C18 pour phase inverse, ou fonctions polaires pour phase normale).
  • Alumine () : Peut être acide, neutre ou basique, utile pour composés sensibles au pH.
• Phase mobile () : Liquide (éther de pétrole, solvants mixtes), gaz (, , ) ou fluide supercritique ()qui entraîne les molécules.
  • Force éluante : Capacité de la à entraîner les solutés.
    • Phase stationnaire polaire : Plus l'éluant est polaire, plus sa force éluante est grande.
    • Phase stationnaire apolaire : Inverse.
  • Modes d'élution :
    • Isocratique : Composition de constante. Simple mais peut donner une mauvaise résolution.
    • Gradient d'élution : Composition de varie. Meilleure séparation pour larges plages d'hydrophobie, mais instrumentation plus complexe.
• Soluté ou Analyte : Composé à séparer (ex: pigments végétaux).
• Colonne chromatographique : Contient la phase stationnaire.

Paramètres Chromatographiques

Courbe et Pic Chromatographique

• Pic chromatographique : Courbe gaussienne représentant la détection d'un composé à sa sortie de colonne.
• Temps mort () : Temps pour les molécules sans interaction avec à traverser la colonne.
• Volume mort () : Volume de correspondant à . (D = débit).
• Temps de rétention () : Temps pour un composé interagissant avec à traverser la colonne.
  • La séparation repose sur les affinités des analytes pour la .
• Volume d'élution () : Volume de nécessaire pour éluer un soluté. .
• Temps de rétention réduit () : . Représente le temps passé dans .

Facteurs Influant la Séparation

• Coefficient de distribution () : . Mesure l'affinité d'un soluté pour par rapport à .
  • Grand pour gazeuse, petit pour liquide.
  • Noms spécifiques : partage (L/L, G/L), adsorption (L/S, G/S), diffusion (exclusion stérique).
  • Des différents sont essentiels pour la séparation.
• Facteur de rétention () ou de capacité : .
  • Paramètre clé pour définir le comportement des colonnes, indépendant du débit (D) ou de la longueur (L).
  • Mesure la capacité d'une colonne à retenir chaque composé.
  • Gain maximal de résolution (R) quand .
• Facteur de séparation () ou sélectivité : ().
  • Caractérise les positions relatives de deux pics adjacents.
  • Influencé par : nature de , température, nature de .
• Nombre de plateaux théoriques () et effectifs () :
  • : Mesure l'efficacité théorique d'une colonne. Plus est grand, meilleure est l'efficacité.
  • (avec la largeur à la base, la largeur à mi-hauteur).
  • (pour comparer des colonnes de tailles différentes).
• Hauteur Équivalente à un Plateau Théorique (HEPT ou ) : . Plus est petit, plus l'efficacité est grande.
• Facteur de résolution () : Quantifie la séparation entre deux composés.
  • .
  • Relation de Purnell : . La résolution dépend de l'efficacité (), de la sélectivité () et de la rétention ().

Perte de Charge et Équation de Van Deemter

• Perte de charge () : Différence de pression entre l'entrée et la sortie de la colonne.
  • (où est la viscosité, la longueur, la vitesse de , le diamètre des particules).
• Équation de Van Deemter : . Décrit la contribution des facteurs à l'élargissement des bandes et à l'efficacité.
  • A (diffusion turbulente) : Indépendant du débit, dépend de la taille et de l'irrégularité des particules. .
  • B (diffusion longitudinale) : Diminue quand la vitesse augmente. Les molécules diffusent dans le sens de l'écoulement. .
  • C (transfert de masse) : Lié aux inégalités de transfert entre les phases. Diminue avec le diamètre des particules.
• Équation de Golay : Spécifique aux colonnes capillaires (sans terme A) en CPG. .

Types de Chromatographie en Phase Liquide (CPL)

La CPL utilise une liquide. Différents types basés sur l'état de la et les mécanismes de rétention :

Chromatographie	Mécanisme de rétention	Phase Stationnaire	Phase Mobile	Caractéristique
Adsorption (Liquide/Solide)	Adsorption physique (polarité)	Solide (polaire : silice vierge, alumine)	Liquide	Composés polaires plus retenus. Ex: Phase normale.
Partage (Liquide/Liquide)	Partage selon la polarité	Liquide (apolaire : C18 greffée)	Liquide	Composés apolaires plus retenus. Ex: Phase inverse.
Ionique (Échange d'ions)	Interactions électrostatiques (charge)	Résine avec sites ioniques	Solution aqueuse tamponnée	Composés plus chargés plus retenus.
Exclusion stérique	Séparation par taille	Matériau poreux	Aqueuse (filtration sur gel) ou organique (perméation sur gel)	Agit comme un tamis moléculaire.
Affinité	Interactions biologiques/chimiques sélectives	Solide greffé (ligand)	Solution aqueuse tamponnée	Molécules plus affines plus retenues.

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

• Utilise une solide ou liquide et une liquide.
• : Composée majoritairement de billes de silice greffées.
• Divers détecteurs (UV-visible, fluorescence, MS) permettent d'obtenir des chromatogrammes.
• Débit : S'adapte à la courbe de Van Deemter.
• Peut être utilisée à différentes échelles : préparative, analytique, nano.

Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG ou GC)

La CPG sépare les analytes à l'état gazeux après vaporisation. Utile pour l'identification et la quantification.

Phases utilisées

• Phase stationnaire () :
  • Liquide immobilisé sur un support inerte ou la paroi de la colonne. (Coefficient de partage K).
  • Solide poreux (charbon actif, silice, alumine) pour gaz ou composés à bas point d'ébullition (Coefficient d'adsorption).
• Phase mobile () : Gaz inerte (, , ).
  • Hélium est le plus souvent préféré malgré la rapidité de (risques d'explosion).
  • Viscosité des gaz augmente avec la température, nécessitant un contrôle électronique de la pression (EPC) pour maintenir un débit constant en programme de .

Fonctionnement

• Ordre de sortie : Principalement selon les températures d'ébullition croissantes (plus volatil = élué rapidement), mais les interactions avec peuvent modifier cet ordre.
• Gradient de température : Permet d'améliorer la résolution lorsque la séparation à constante est insuffisante.

Colonnes et Injection en GC

• Colonnes :

  Colonne	Remplie	Capillaire
  Longueur	1 à 3 m	20 à 100 m
  Diamètre interne	4 à 10 mm	100 à 530 m
  Support	Poreux (grains de silicates)	Silice fondue
  Phase stationnaire	Immobilisée sur support	Film de 0,05 à 5 m

• Phases les plus utilisées :
  • Polysiloxanes (greffées sur silice via ponts Si-O-Si, polarité variable).
  • Polyéthylènes glycols (plus polaires, via ponts Si-O-C, sensibles à l'oxygène).
• Modes d'injection :
  • Splitless : Pour analyse de traces (tout l'échantillon en colonne).
  • Split : Pour échantillons concentrés (fraction de l'échantillon en colonne pour ne pas saturer). .

Détection en GC

• FID (Flame Ionization Detector) : Le détecteur le plus courant et sensible pour la plupart des composés organiques carbonés.
  • Très sensible (20-100 pg), large gamme de linéarité ().
  • Ne détecte pas les composés inorganiques simples (, , ).

Récapitulatif - Chromatographie (Points Clés)

• Objectif : Séparer, identifier et/ou quantifier les constituants d'un mélange.
• Principes : Basé sur les différences d'affinité des analytes entre une phase stationnaire (fixe) et une phase mobile (en mouvement).
• Paramètres de performance :
  • Efficacité (, ) : Largeur des pics. Meilleure avec N élevé et H faible.
  • Sélectivité () : Séparation entre les pics. Dépend de la nature des phases.
  • Rétention () : Position des pics. Dépend des interactions analytes/.
  • Résolution () : Qualité globale de la séparation, combinaison de , , .
• Avantages GC : Sensibilité, polyvalence, rapidité, automatisation.