Enzymes de restriction et hydrolyse de l’ADN

Acides Nucléiques : L'Essentiel

Les acides nucléiques sont des macromolécules biologiques, supports et transmetteurs de l'information génétique. Ils sont formés d'unités appelées nucléotides. On distingue l'ADN et l'ARN.

I. Les Bases Azotées

Les bases azotées sont des composés hétérocycliques, faiblement basiques et caractérisées par des cycles azotés et carbonés. Leur numérotation est spécifique.

A. Bases Puriques

• Dérivent du noyau purine (pyrimidine + imidazole).

• Deux principales bases :

  • Adénine (A) : 6-amino-purine.

  • Guanine (G) : 2-amino-6-oxy-purine.

• Dérivés importants :

  • Dérivés hydroxylés (catabolisme) : hypoxanthine, xanthine, acide urique.

  • Dérivés méthylés : structure de t-RNA.

  • Applications médicales : 6-mercaptopurine, 8-azaguanine, Allopurinol.

  • Dérivés végétaux : caféine, théophylline, théobromine.

B. Bases Pyrimidiques

• Dérivent du noyau pyrimidine.

• Trois principales bases :

  • Cytosine (C).

  • Uracile (U) : Présent dans l'ARN.

  • Thymine (T) : Uracile méthylée, présente dans l'ADN.

• Dérivés de synthèse : 2-thio-uracile (anti-thyroïdien), fluoro-uracile (bactériostatique).

C. Propriétés des Bases Azotées

• Faible solubilité dans l'eau.

• Absorption intense dans le Spectre Ultra-Violet (UV).

• Existence de formes tautomères (équilibre influencé par le milieu).

II. Les Nucléotides

Les nucléotides sont des esters phosphoriques de nucléosides (nucléosides phosphorylés) ou des dérivés de nucléosides. Ils sont des unités fondamentales des acides nucléiques.

A. Constitution des Nucléosides et Nucléotides

1. Pentoses :

   • βD-Ribofuranose (dans l'ARN) : Réagit avec l'orcinol (réaction de Bial).

   • βD-2'-Désoxyribofuranose (dans l'ADN) : Réagit avec la fuschine (réaction de Feulgen).

2. Acide Orthophosphorique : H₃PO₄.

3. Bases azotées.

1. Nucléosides

Combinaison d'une base azotée et d'un pentose. On distingue les ribonucléosides et désoxyribonucléosides.

2. Nucléotides

Nucléosides estérifiés par un ou plusieurs groupes phosphate. La plupart sont de type 5'.

B. Fonctions des Nucléotides

• Précurseurs des acides nucléiques : (dATP, dGTP, dCTP, dTTP pour l'ADN).

• Stockage et transfert d'énergie : ATP, GTP (liaisons riches en énergie).

• Régulateurs métaboliques : AMPc, GMPc (réponse au monoxyde d'azote).

• Intermédiaires pour la biosynthèse de macromolécules : UDP (transporteur de galactose), CDP (transporteur d'éthanolamine).

• Transporteurs d'électrons : NAD+, FAD (liés à la production d'énergie).

• Médecine clinique :

  • Allopurinol (analogue de l'hypoxanthine).

  • Azathioprine (immunosuppresseur).

  • Chimiothérapie du cancer (ex : 5-fluorouracile).

III. Acides Ribonucléiques (ARN)

Macromolécules contenant du D-ribofuranose, de l'acide phosphorique et des bases (A, G, C, U).

• Les nucléotides sont unis par des liaisons 3'-5' phosphodiester.

• Conformation pseudo-hélicoïdale par appariements entre bases complémentaires.

A. Les ARN Ribosomiques (ARNr ou rRNA)

• Majorité de l'ARN cellulaire.

• Riches en guanine et cytosine.

• Contiennent des bases méthylées ou pseudo-uridine.

• Constituent les ribosomes en deux sous-unités (grande et petite), avec des classes spécifiques (23-28S, 16-18S, 5-5,8S). Eucaryotes : 80S (60S, 40S).

B. Les ARN de Transfert (ARNt ou tRNA)

• Indispensables au transfert des acides aminés pendant la biosynthèse des protéines.

• Contiennent entre 75 à 90 nucléotides.

• Rôle : Apporter les résidus d'acides aminés à la chaîne protéique en croissance.

C. Les ARN Messagers (ARNm ou mRNA)

• Produit de la transcription des gènes, séquence complémentaire de l'ADN.

• Existe en une seule chaîne, organisée en triplets de bases (codons).

• Chaque codon correspond à un acide aminé.

• Apporte au cytoplasme l'information génétique pour la synthèse protéique.

IV. Acides Désoxyribonucléiques (ADN)

Macromolécules contenant du β-2'-désoxyribofuranose, de l'acide phosphorique et des bases (A, G, C, T).

• Pas d'uracile (U) dans l'ADN, remplacé par la thymine (T).

• Principaux désoxyribonucléotides : dAMP, dGMP, dCMP, dTMP.

A. Structure Secondaire de l'ADN

• Conformation hélicoïdale (double hélice de Watson et Crick).

• Composé de deux brins de nucléotides avec trois propriétés essentielles :

  • Antiparallèles : Lecture en sens opposé (5' → 3').

  • Complémentaires : Appariement spécifique des bases (A-T et C-G).

    • A avec T : 2 liaisons hydrogène.

    • C avec G : 3 liaisons hydrogène.

    • Règle de Chargaff : .

  • Hélicoïdaux : Double hélice à pas droit.

    • Plans des bases perpendiculaires à l'axe.

    • 10 paires de bases par tour d'hélice.

    • Pas de l'hélice = 3,4 nm.

    • Diamètre de l'hélice = 2 nm.

    • Présence de sillons majeur et mineur pour la reconnaissance spécifique.

B. Propriétés Générales des Acides Nucléiques

• Représentation : 5' → 3' (pNpN...).

• Poids moléculaire (PM) : Très élevé. ADN (millions), ARN (25 000 à millions).

• Solubilité : Dans phénol, solutions salines et alcalines. Précipités par alcool et solutions acides.

• Acidité : Très acides en solution aqueuse.

• Absorption UV : Maximum à 260 nm (présence de doubles liaisons conjuguées).

  • Effet hyperchrome : Augmentation de l'absorption UV lors de la dégradation.

• Viscosité : Les solutions d'ADN sont très visqueuses due à la rigidité et longueur des chaînes.

• Dénaturation (fusion) : La chaleur sépare les 2 brins d'ADN.

  • Tm (température de fusion) : Température à laquelle 50% des brins sont séparés. Elle augmente avec le pourcentage de G-C.

  • Courbe de fusion : variation de l'absorbance en fonction de la température.

  • La dénaturation est réversible (réappariement ou annealing) si la température est inférieure à la Tm.

  • Hybridation : Phénomène de reconnaissance entre séquences complémentaires avec formation de liaisons hydrogène.

  C. Hydrolyse des Acides Nucléiques

  L'hydrolyse peut être acide ou enzymatique.

  1. Hydrolyse Acide

  • Donne un acide apurinique (élimination préférentielle des bases puriques).

  2. Hydrolyse Enzymatique : Nucléases

  Les nucléases sont des enzymes qui hydrolysent les liaisons phosphodiester.

  • Exonucléases : Libèrent les nucléotides à partir des extrémités (5' ou 3').

    • Classe a (ex : phosphodiestérase du venin) : Coupe à partir de l'extrémité 3' OH (liaisons a).

    • Classe b (ex : phosphodiestérase splénique) : Coupe à partir de l'extrémité 5' OH (liaisons b).

  • Endonucléases : Coupent les liaisons ester internes.

    • Ribonucléases (spécifiques de l'ARN) :

      • Ribonucléase I (pancréatique) : Coupe les liaisons b si la liaison a est fixée sur un nucléotide pyrimidique.

      • Ribonucléase T1 : Coupe les liaisons b si la liaison a est liée à un nucléotide guanylique.

      • Ribonucléase T2 : Coupe les liaisons b si la liaison a est liée à un nucléotide pyrimidique ou adénylique.

    • Désoxyribonucléases (spécifiques de l'ADN) :

      • Désoxyribonucléase I (DNAse I, classe a) : Coupe la liaison a entre une base purique et une pyrimidique.

      • Désoxyribonucléase II (DNAse II, classe b) : Coupe la liaison b entre une base pyrimidique et une purique.

    • Endonucléases de restriction : (d'origine bactérienne)

      • Rôle : Éliminer l'ADN étranger par coupure hydrolytique.

      • Agissent sur des séquences spécifiques : palindromes (identiques sur les deux brins en sens 5' → 3').

      • Exemples :

        • Eco RI : Site reconnu G/AATTC.

        • Sma I : Site reconnu CCC/GGG.

        • Pst I : Site reconnu CTGCA/G.

      • Types de coupures :

        • Bouts francs : Coupure au milieu du palindrome.

        • Bouts collants/cohésifs : Coupure décalée, laissant des séquences monocaténaires.