Cytogénétique moléculaire: FISH et CGH

Lacytogénétique moléculaire a révolutionné l'exploration des anomalies chromosomiques, supplantant le caryotype traditionnel par des techniques plus résolutives.

Points Clés de la Cytogénétique Moléculaire

Généralités

• Cytogénétique Médicale en Révolution : Le caryotype (1956) n'est plus l'examen de première intention.
• ACPA (Analyse Chromosomique sur Puce à ADN) : Prend le relais depuis les années 1980.
• Résolution Supérieure : L'ACPA est10 à 1000 fois plus résolutive que le caryotype (5-10 Mb).
• Précision : Détermine taille et localisation d'un segment remanié pourles corrélations phénotype-génotype.
• Applications : Détection de pertes/gains de matériel chromosomique pour déficience intellectuelle, malformations congénitales, pathologies neuropsychiatriques.
• Rôle du Cytogénéticien : Devient un "interniste" de la pathologie génomique.
• Impact Limité dans les Cancers : Pour les hémopathies malignes, le FISH et la RT-PCR restent les examens de choix, avec le caryotype.
• Outil de Recherche : L'ACPA est précieux pour l'identification de gènes impliqués dans pathologies constitutionnelles et acquises.

I. Cytogénétique Moléculaire : Aspects Techniques

I.1. L'Hybridation inSitu Fluorescente (FISH)

La première technique de cytogénétique moléculaire, basée sur les propriétés de dénaturation et renaturation de l'ADN.

I.1.1. Historique

• 1981 : Équipe de David Ward développe la FISH, permettant de visualiser les loci sur chromosomes.
• Principe : Intégration d'un nucléotide par voie chimique et utilisation d'un microscope fluorescent.
• Aujourd'hui : Possibilité d'étudier simultanément plus de 20 loci.

I.1.2. Les Sondes

Fragments d'ADN de tailles variées, spécifiques de régions chromosomiques.

• Sondes d'ADN Répété :
  • Taille : Moins de 1000 paires de bases (1 kilobase).
  • Cible : Séquences répétées en tandem (ex: centromères).
  • Signal : Ponctuel et de forte intensité.
• Sondes de Séquences Uniques :
  • Spécifiques de loci ou de bras chromosomiques entiers.
  • Sondes Spécifiques de Loci :
  • Utilisation de BAC (bacterial artificial chromosome) de 100-200 kb.
  • Autres vecteurs : fosmides, cosmides, phages, plasmides, chromosomes artificiels de levures(YAC).
• Sondes de Peinture Chromosomique :
  • Ensemble de fragments d'ADN représentant un chromosome entier.
  • Permettent d'hybrider une paire chromosomique donnée.

I.1.3. Le Marquage

Introduction de fluorochromes dans un fragment d'ADN.

• Ancien procédé (années 1980) :Nucléotides (d'UTP) couplés à des haptènes (digoxigénine, biotine) puis révélés par anticorps/streptavidine couplés à des fluorochromes.
• Actuel : Fluorochromes directement fixés sur les nucléotides.
• Procédés d'incorporation :
  • Random priming et nick translation.
• Fluorochromes : Molécules excitable à une longueur d'onde (λexc) et émettant à une autre (λém).
• Fluorochromes couramment utilisés :
  • DAPI (310 nm-372nm) : Se fixe sur les régions riches en AT, colore tous les chromosomes.
  • FITC (λexc 495nm - λem 519 nm) : Fluoresce en vert.
  • Cyanine 3 (CY3) (λexc 495nm - λem 519 nm) : Fluoresce en orange.
  • Texas Red (λexc 589 nm - λem 615 nm) : Fluoresce en rouge.
  • Cyanine 5 (λexc 650 nm - λem 670 nm) : Fluoresce en infra-rouge.
  • Cyanine 5,5 (λexc 675 nm - λem 694 nm) : Fluoresce en infra-rouge.

I.1.4. La Multofluorescence

Permet l'étude simultanée de plusieurs loci.

• Principe : Utilisation de sondes marquées avec différents fluorochromes sans chevauchement spectral.
• Possibilité de marquer une sonde avec plusieurs fluorochromes pour unefluorescence complexe, analysée numériquement.
• Avec 5 fluorochromes, 31 combinaisons possibles permettent de construire 23 sondes de peinture pour le caryotype en multifluorescence.

I.1.5. L'Hybridation

Rencontre de la sonde dénaturée et de l'ADN chromosomique dénaturé.

• Efficacité : Dépend du temps d'hybridation et de la concentration de la sonde.
• Durée : 5 min (sondes centromériques) à 24-48h (sondes de peinture).
• Hybridation Compétitive :
  • L'ADN contient 45%de séquences répétées et 65% de séquences uniques.
  • Pour éviter les signaux aspécifiques des séquences répétées, Legoer et al. (1986) ajoutent un excès d'ADN non marqué riche en séquences répétées(Cot 1).

I.1.6. La Microscopie en Épifluorescence

Visualisation des fluorochromes excités.

• Principe Général :
  1. Source lumineuse (lampes à mercure/xénon) émet de la lumière blanche.
  2. Le filtre d'excitation sélectionne une λexc.
  3. Le miroir dichroïque réfléchit la λexc versla préparation.
  4. Le fluorochrome excité émet une λem d'intensité plus faible.
  5. La λem traverse le miroir dichroïque et le filtre d'émission (élimine les longueurs d'ondes parasites).
  6. La λem est transmise aux oculaires ou à une caméra pour numérisation.
• La Multofluorescence :
  • Développement des caryotypes en multifluorescence grâce aux sondes multi-marquées et aux caméras numériques.
  • Deux Procédés :
    1. Numérisation Successive :
       • La caméra capture successivement les signaux des différentes sondes.
       • Ex: Première image souvent générée par DAPI.
       • Superposition des signaux pour étude précise des loci.
       • Speicher et al. (1996) ont établi un caryotype en multifluorescence avec 23 sondes de peinture et un logiciel.
    2. Analyse Spectrale :
       • Méthode plus complexe avec un interféromètre pour décomposer et analyser le contenu en longueur d'onde de la lumière.
       • Décrit en 1996 par Schrock et al.

I.1.7. Limites de la Technique FISH

• Sondes Spécifiques de Loci : Technique ciblée, n'explore pas l'ensemble du génome comme le caryotype.
• Sondes de Peinture :
  • Résolution : 1,5 Mb pour la détection des translocations télomériques.
  • Non utiles pour déterminer la région lors d'insertions chromosomiques.
  • Pas d'une grande utilité pour la détection des délétions.

I.2. L'Hybridation Génomique Comparative sur Réseau d'ADN (CGH-array)

I.2.1. Historique et Principe de la CGH (sur métaphase)

• 1992 : Équipe de Dan Pinkel développe laCGH.
• Principe : Comparaison du nombre de molécules d'ADN de deux individus (patient vs. témoin) marqués par des fluorochromes différents et hybridés sur des métaphases d'un témoin.
• Analyse : Numérisation des signaux,calcul du ratio d'intensité patient/témoin.
• Ratio d'Intensité :
  • Proche de 1 : Nombre de molécules identique.
  • 0,5 : Délétion.
  • 1,5 : Trisomie.
• Avantage : S'affranchit de l'analyse morphologique des chromosomes, analyse le contenu global en ADN.
• Limites de la CGH sur métaphase :
  • Détecte uniquement les déséquilibres génomiques.
  • Ne détecte pas les anomalies chromosomiques équilibrées ni les anomalies en faible mosaïque.
  • Résolution : Cellede la bande chromosomique (5-10 Mb).

I.2.1. Version Améliorée : CGH-array ou ACPA

• Fin des années 1990 : Solinas-Toldo et Pinkel et al. transfèrent la CGH sur des lames avec des fragments d'ADN fixés ("sondes").
• Microarray ou Puce à ADN : Support physique avec des séquences génomiques fixes.
• Processus :
  • Même quantité d'ADN témoin et ADN patient (marqués différemment) est déposée sur la lame.
  • Calcul du rapport d'intensité de fluorescence au niveau de chaque sonde.
  • Logiciels dédiés pour le traitement statistique des données.
  • Résultats graphiques : Chaque "point" représente le ratio d'intensité d'une sonde, placés sur les idéogrammes des chromosomes.
• Détection des Déséquilibres :Se fait par la déviation du ratio d'intensité de fluorescence au niveau des sondes, non plus des bandes chromosomiques.
• Résolution : Dépend du nombre et de la localisation des sondes.
  • Premières "puces pangénomiques" : 3000 clones BAC/PAC, résolution moyenne de 1 Mb (5 fois supérieure au caryotype haute résolution).
  • Ishkanian et al. : 32433 BAC chevauchants, résolution de 30 Kb.
  • Milieu des années 2000 : Puces à oligonucléotides (60-80 bases), plusieurs millions d'oligonucléotides, résolution de quelques centaines de paires de bases.
• CNV (Copy Number Variation) : Déséquilibre génomique de plus de 1 Kb détecté par CGH-array.

I.2.1. Une Variante : Les Puces à SNP

• SNP (Single Nucleotide Polymorphism) : Variations sur une seule paire de base, distribuées uniformément (10 millions de SNP, 1 tous les 100-1000 pb).
• Oligonucléotides surlame : Possibilité de fixer des oligonucléotides contenant des SNP, avec les deux allèles pour un locus donné.
• Avantages des Puces SNP :
  • Détection des isodisomies uniparentales (perte d'hétérozygotie).
  • Possibilité de déterminer l'origine parentale d'un remaniement avec l'étude des parents.
• Détection de Perte d'Hétérozygotie : Si un seul allèle estdétecté.
• Autres applications : Initialement pour l'haplotypage et l'analyse de liaison, mais donnent aussi des informations sur le nombre de copies d'ADN.
• Automatisation : Ces techniques sont entièrement automatisables, permettant l'étude des déséquilibres génomiques à haut débit.
• ACPA : L'acronyme désigne à la fois la CGH-array et les puces à SNP.

Note: Les images mentionnées dans le texte source n'ont pas été reproduitesici.