Cytogénétique moléculaire: FISH et CGH
140 cartesDr. Robert DIATTA présente la cytogénétique moléculaire, explorant la FISH (Hybridation in situ fluorescente) avec ses aspects historiques, sondes, marquage et multifluorescence. Ensuite, il aborde la CGH (Hybridation génomique comparative) et la CGH-array, ainsi que les puces à SNP (Single nucléotide polymorphismes), détaillant leurs principes et limites. En somme, une présentation des techniques clés en cytogénétique.
120 cartes
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Par quoi le caryotype est-il aujourd'hui supplanté en première intention?
Réponse
Par l'analyse chromosomique sur puce à ADN (ACPA), qui a une résolution 10 à 1000 fois supérieure.
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Que signifie l'acronyme FISH?
Réponse
Fluorescence In Situ Hybridization, ou hybridation in situ fluorescente en français.
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Que permet la haute résolution de l'ACPA?
Réponse
De déterminer précisément la taille et la localisation d'un remaniement, facilitant les corrélations phénotype-génotype.
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Sur quel principe fondamental repose la technique de FISH?
Réponse
Sur les propriétés de dénaturation (séparation) et de renaturation (ré-association) des brins d'ADN.
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Qui a mis au point la FISH et en quelle année?
Réponse
L'équipe de David Ward en 1981, en intégrant un nucléotide par voie chimique.
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Quels sont les deux grands types de sondes ADN utilisées en FISH?
Réponse
Les sondes à séquences d'ADN répétées (ex: centromères) et les sondes à séquences uniques (ex: loci spécifiques).
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Qu'est-ce qu'une sonde de peinture chromosomique?
Réponse
Un ensemble de fragments d'ADN marqués qui s'hybrident sur toute la longueur d'une paire chromosomique spécifique.
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Quel est le but de l'étape de marquage en FISH?
Réponse
Introduire des fluorochromes (molécules fluorescentes) dans un fragment d'ADN pour le visualiser.
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Qu'est-ce qu'un fluorochrome?
Réponse
Une molécule qui, excitée par une longueur d'onde, restitue de l'énergie lumineuse à une longueur d'onde d'émission plus faible.
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Citez un fluorochrome courant et sa couleur.
Réponse
Le FITC (fluorescein isothiocyanate) émet dans le vert, ou la Cyanine 3 (CY3) dans l'orange.
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À quoi sert le DAPI lors d'une analyse FISH?
Réponse
Il colore l'ensemble des chromosomes en bleu, ce qui permet de les repérer sur la préparation.
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Que permet la multidiscipline en FISH?
Réponse
D'étudier simultanément plusieurs loci en utilisant des sondes marquées avec des fluorochromes de couleurs différentes.
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En quoi consiste l'hybridation compétitive?
Réponse
À ajouter un excès d'ADN non marqué (Cot 1) pour bloquer les signaux aspécifiques dus aux séquences répétées du génome.
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Que signifie l'acronyme CGH?
Réponse
Comparative Genomic Hybridization, ou hybridation génomique comparative.
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Quel est le principe de la CGH sur métaphase?
Réponse
Comparer l'ADN d'un patient et d'un témoin en les hybridant sur les chromosomes d'un individu de référence.
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Quelle est la principale limite de la CGH sur métaphase?
Réponse
Sa résolution reste limitée à celle de la bande chromosomique, soit 5-10 Mb.
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Qu'est-ce qu'une puce à ADN (ou microarray)?
Réponse
Une lame sur laquelle sont fixées des milliers de séquences génomiques (sondes) représentant une partie du génome.
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Qu'est-ce qu'un CNV (Copy Number Variation)?
Réponse
Une variation du nombre de copies d'ADN, correspondant à un déséquilibre génomique (gain ou perte) de plus de 1 kb.
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Quel est l'avantage des puces à SNP?
Réponse
Elles peuvent détecter les pertes d'hétérozygotie (isodisomies uniparentales) en plus des variations du nombre de copies.
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Quelle est la principale limite de la technique FISH avec des sondes de loci?
Réponse
C'est une technique d'étude ciblée, qui n'explore donc pas l'ensemble du génome comme un caryotype.
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Quel est le nouveau rôle du cytogénéticien avec l'ACPA?
Réponse
Il devient un « interniste » de la pathologie génomique, interprétant les déséquilibres pangénomiques.
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Dans quelles pathologies la FISH et le caryotype restent-ils essentiels?
Réponse
Dans les hémopathies malignes, où l'impact de l'ACPA est plus limité pour le diagnostic en routine.
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Quel type de vecteur est utilisé comme sonde FISH pour les loci de 100-200 kb?
Réponse
Les BAC (Bacterial Artificial Chromosome), ou chromosomes artificiels de bactéries.
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Citez deux méthodes pour incorporer des fluorochromes dans une sonde ADN.
Réponse
Le random priming et la nick translation.
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Comment les sondes FISH étaient-elles révélées avant les fluorochromes directs?
Réponse
Via des haptènes (biotine, digoxigénine) reconnus par des anticorps ou de la streptavidine couplés à un fluorochrome.
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Quel fluorochrome produit une fluorescence dans le rouge?
Réponse
Le Texas Red (λem 615 nm), souvent utilisé en marquage multiple.
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Combien de combinaisons de sondes peut-on obtenir avec 5 fluorochromes?
Réponse
31 combinaisons, permettant de créer un caryotype en multifluorescence avec une sonde pour chaque chromosome.
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De quoi dépend principalement le temps d'hybridation d'une sonde?
Réponse
De sa complexité : de quelques minutes pour une sonde centromérique à 48h pour une sonde de peinture.
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Qui a développé la CGH (Hybridation Génomique Comparative) et en quelle année?
Réponse
L'équipe de Dan Pinkel en 1992, pour comparer quantitativement deux génomes.
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Quel est le rôle du miroir dichroïque en microscopie à fluorescence?
Réponse
Il réfléchit la lumière d'excitation sur la lame et laisse passer la lumière d'émission vers la caméra.
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Quelles sources lumineuses sont employées en microscopie à épifluorescence?
Les lampes à mercure ou à Xénon, qui génèrent une lumière blanche riche en longueurs d'onde.
Qui a mis au point le caryotype multifluorescence par classification spécifique?
Speicher et al. en 1996, en utilisant des combinaisons de fluorochromes pour chaque chromosome.
Qui a développé l'analyse spectrale des signaux FISH avec un interféromètre?
L'équipe de Schrock et al. en 1996, permettant une analyse plus complexe des signaux lumineux.
Quelles anomalies ne sont pas détectées par la CGH sur métaphase?
Les anomalies équilibrées (translocations, inversions) et les anomalies en faible mosaïque.
Comment sont représentés les résultats d'une analyse par puce à ADN?
Sous forme de graphique où chaque point représente le ratio de fluorescence pour une sonde, placé sur un idéogramme.
Quelle était la résolution des premières puces à ADN pangénomiques?
Une résolution moyenne d'une mégabase (1 Mb), soit 5 fois plus que le caryotype haute résolution.
Qu'est-ce qu'un oligonucléotide sur une puce à ADN moderne?
Une très courte séquence d'ADN simple brin (60-80 bases ou
Quelle est la fréquence moyenne des SNP dans le génome humain?
On trouve en moyenne un SNP tous les 100 à 1000 paires de bases.
Dans quel but initial les puces à SNP ont-elles été conçues?
Pour des fins d'haplotypage et d'analyse de liaison génétique.
Quel acronyme commun désigne la CGH-array et les puces à SNP?
ACPA, pour Analyse Chromosomique sur Puce à ADN.
Dans quels cancers l'ACPA a-t-elle un impact diagnostique limité?
Principalement dans les hémopathies malignes, où le caryotype, la FISH et la RT-PCR restent les examens de choix.
Quels vecteurs sont utilisés comme sondes de loci en FISH?
Des BAC (chromosomes bactériens artificiels), cosmides, phages, plasmides, ou des chromosomes artificiels de levure (YAC).
Comment étaient marquées les sondes FISH avant le marquage direct?
Par des haptènes (digoxigénine, biotine), révélés par des anticorps couplés à des fluorochromes.
Citez deux techniques pour incorporer un fluorochrome à l'ADN.
Le random priming (amorçage aléatoire) et la nick translation (translation de coupure par une entaille).
Quelle est la couleur de fluorescence du Texas Red?
Il émet une fluorescence dans le rouge, avec une longueur d'onde d'émission (λem) de 615 nm.
De quoi dépend l'efficacité d'une hybridation en FISH?
Elle dépend du temps d'hybridation et de la concentration de la sonde utilisée.
Qui a initié l'hybridation compétitive?
L'équipe de Legoer et al. en 1986, en ajoutant un excès d'ADN non marqué riche en séquences répétées (Cot 1).
Quelle est la source lumineuse d'un microscope à épifluorescence?
Des lampes à mercure ou à xénon, qui génèrent une lumière blanche contenant l'ensemble des longueurs d'onde.
Quel composant du microscope sélectionne la longueur d'onde d'excitation?
Un filtre d'excitation, qui sélectionne une bande de longueurs d'onde spécifique avant le miroir dichroïque.
Par qui le caryotype en multifluorescence a-t-il été établi?
Par l'équipe de Speicher et al. en 1996, en classant les chromosomes selon leur fluorescence spécifique.
Quel dispositif permet l'analyse spectrale des signaux FISH?
Un interféromètre, qui décompose et analyse le contenu spectral d'une lumière complexe en un seul temps.
Quelle est une limite majeure des sondes de peinture chromosomique?
Elles ne permettent pas de déterminer la région chromosomique d'origine d'une insertion.
Qui a mis au point la CGH sur métaphase?
L'équipe de Dan Pinkel en 1992.
Quels sont les ratios théoriques d'intensité en CGH?
Le rapport théorique patient/témoin est de 0,5 pour une délétion et de 1,5 pour une trisomie.
Quelles anomalies ne sont pas détectées par la CGH sur métaphase?
Les anomalies équilibrées (translocations, inversions) et les anomalies en faible mosaïque.
Comment sont visualisés les résultats d'une analyse par puce à ADN?
Sous forme de graphique où chaque "point" représente le ratio d'intensité de fluorescence d'une sonde, placé sur un idéogramme chromosomique.
Quelle était la résolution des premières puces pangénomiques?
Environ une mégabase (1 Mb), soit 5 fois plus que le caryotype en haute résolution.
Quelle est la résolution permise par les puces à oligonucléotides?
Elles atteignent une résolution de quelques centaines de paires de bases.
À quelles fins les puces à SNP ont-elles été développées?
Initialement pour l'haplotypage et l'analyse de liaison génétique.
Que couvre l'acronyme ACPA?
Il désigne aussi bien la technique de CGH-array que celle des puces à SNP.
Quels haptènes étaient utilisés en FISH avant le marquage direct?
La digoxigénine et la biotine, révélées par des anticorps ou de la streptavidine couplés à des fluorochromes.
Citez deux méthodes pour incorporer un fluorochrome dans l'ADN.
Le marquage par amorces aléatoires (random priming) et la translation de coupure (nick translation).
Dans quelle couleur le Texas Red émet-il sa fluorescence?
Il émet une fluorescence dans le rouge.
Qu'est-ce qu'un BAC et quel fut son rôle dans le séquençage?
Un Chromosome Artificiel Bactérien, utilisé pour cloner des fragments d'ADN de 100-200 kb pour le séquençage du génome.
Outre les BACs, citez deux autres vecteurs utilisés comme sondes.
Les fosmides, cosmides, phages, ou les chromosomes artificiels de levure (YAC).
De quoi dépend l'efficacité d'une hybridation en FISH?
Du temps d'hybridation et de la concentration de la sonde.
Quel est le temps d'hybridation pour les sondes de peinture chromosomique?
Le temps varie de 24 à 48 heures pour ces sondes complexes.
Par quoi la lumière blanche est-elle générée en microscopie à épifluorescence?
Par des lampes à mercure (pics d'intensité) ou des lampes à Xénon (intensité homogène).
Quel est le rôle du miroir dichroïque dans un microscope?
Réfléchir la longueur d'onde d'excitation et laisser passer la longueur d'onde d'émission vers le détecteur.
Qui a développé la technique de la CGH et en quelle année?
L'équipe de Dan Pinkel en 1992.
En CGH, quel est le ratio d'intensité théorique en cas de délétion?
Le rapport théorique est de 0,5.
En CGH, quel est le ratio d'intensité théorique en cas de trisomie?
Le rapport théorique est de 1,5, comme pour la trisomie 21.
Quelles anomalies la CGH sur métaphase ne détecte-t-elle pas?
Les anomalies équilibrées et les anomalies en faible mosaïque.
Qu'est-ce que la « cible » dans une expérience de CGH-array?
Le mélange d'ADN du patient et d'ADN témoin, marqués chacun par un fluorochrome différent, qui est déposé sur la lame.
De quoi dépend la résolution d'une puce à ADN?
Du nombre de sondes fixées et de leur localisation sur le génome.
Quelle résolution avaient les premières puces pangénomiques à clones BAC?
Une résolution moyenne d'une mégabase (1 Mb), soit 5 fois supérieure au caryotype haute résolution.
Quel type de sondes utilise-t-on sur les puces à oligonucléotides?
Des oligonucléotides simple brin d'environ 60-80 bases, qui peuvent atteindre plusieurs millions par lame.
Qu'est-ce qu'un SNP (Polymorphisme Nucléotidique Simple)?
Une variation de la séquence d'ADN portant sur une seule paire de base.
Quelle est la fréquence des SNP dans le génome humain?
On estime un SNP tous les 100 à 1000 paires de bases.
Pour quelles pathologies la FISH reste-t-elle un examen de choix?
Dans les cancers, particulièrement les hémopathies malignes, avec le caryotype et la RT-PCR.
Dans quel domaine l'impact de l'ACPA est-il plus limité ?
Dans les cancers, et en particulier les hémopathies malignes, où le caryotype et la FISH restent des examens de choix.
Quelles techniques sont privilégiées pour les hémopathies malignes ?
La FISH, la RT-PCR et le caryotype restent les examens de choix pour le diagnostic en routine de ces pathologies.
Qu'est-ce que l'étape d'hybridation en FISH ?
Une étape où la sonde marquée est mise en présence de l'ADN cible (chromosomes, noyaux) après une étape de dénaturation.
Comment les premières sondes spécifiques de loci ont-elles été créées ?
Le génome a été fragmenté en segments de 100-200 kb, puis cloné dans des vecteurs comme les BAC (chromosomes artificiels de bactéries).
Que sont les vecteurs BAC ?
Il s'agit de chromosomes artificiels de bactéries (Bacterial Artificial Chromosome), utilisés comme vecteurs pour cloner et amplifier des fragments d'ADN.
Citez deux procédés de marquage d'une sonde ADN.
Le random priming et la nick translation sont les deux procédés les plus connus pour incorporer un fluorochrome dans un fragment d'ADN.
Quel est le rôle du miroir dichroïque en microscopie ?
Il réfléchit la longueur d'onde d'excitation vers la lame et laisse passer la longueur d'onde d'émission (plus faible) vers l'observateur.
Qu'est-ce qu'un polymorphisme nucléotidique (SNP) ?
Une variation de la séquence d'ADN portant sur une seule paire de base, répartie uniformément dans le génome humain.
De quoi dépend la résolution d'une puce à ADN ?
Du nombre de sondes fixées sur la lame et de leur localisation précise tout au long du génome.
Que sont les oligonucléotides sur une puce ?
Ce sont des séquences d'ADN simple brin d'environ 60-80 bases, fixées sur la lame, qui servent de sondes spécifiques.
Quelle est la principale limite de la CGH ?
Elle ne détecte que les déséquilibres génomiques. Les anomalies équilibrées (translocations, inversions) et les faibles mosaïques ne sont pas visibles.
Quelles sont les valeurs du ratio en CGH pour une délétion ou une trisomie?
La valeur théorique du ratio est de 0,5 pour une délétion, et de 1,5 pour une trisomie (ex: trisomie 21).
Que signifie l'acronyme ACPA et que désigne-t-il ?
Analyse Chromosomique sur Puce à ADN. Cet acronyme désigne aussi bien la technique de CGH-array que celle des puces à SNP.
Quelles sources lumineuses sont utilisées en microscopie par épifluorescence ?
Des lampes à mercure (pics d'intensité) ou des lampes à Xénon (intensité plus homogène).
Sur quelle mesure repose la détection d'un déséquilibre en CGH ?
Sur un rapport d'intensité de fluorescence entre l'ADN d'un patient et celui d'un témoin, hybridés sur une cible commune.
Qu'est-ce qu'un caryotype en multifluorescence ?
Il s'agit d'un caryotype où chaque paire de chromosomes est identifiée par une couleur spécifique grâce à des sondes de peinture chromosomique.
Quelle est la résolution de la CGH sur métaphase ?
Sa résolution est celle de la bande chromosomique, soit 5 à 10 Mb, ce qui est bien inférieur à la CGH-array.
Comment peut-on augmenter le nombre de cibles analysables en une seule FISH ?
En utilisant plusieurs fluorochromes pour marquer une sonde, on obtient une fluorescence complexe analysable uniquement après numérisation.
En quoi consiste l'analyse spectrale des signaux en multifluorescence ?
C'est une méthode d'analyse complexe qui utilise un interféromètre pour décomposer et analyser le contenu en longueur d'onde d'une lumière complexe.
De quoi dépend la durée d'hybridation d'une sonde ?
Le temps d'hybridation varie de 5 minutes pour les sondes centromériques à 24 ou 48 heures pour les sondes de peinture.
Quel vecteur est un chromosome artificiel de bactérie utilisé comme sonde en FISH?
Le BAC (Bacterial Artificial Chromosome), qui permet de cloner des fragments d'ADN de 100 à 200 kb.
De quoi provient l'ADN des sondes de peinture chromosomique?
De chromosomes triés par cytométrie de flux ou de lignées d'hybrides somatiques contenant un seul chromosome humain.
Citez deux méthodes pour incorporer des fluorochromes à l'ADN.
Le random priming (amorçage aléatoire) et la nick translation (translation de coupure).
Citez un fluorochrome émettant dans le rouge.
Le Texas Red (λem 615 nm).
Quel est le rôle du miroir dichroïque en microscopie à épifluorescence?
Il réfléchit la longueur d'onde d'excitation vers l'échantillon et laisse passer la longueur d'onde d'émission vers le détecteur.
Quelles sont les deux principales lampes utilisées en microscopie à fluorescence?
Les lampes à mercure, avec des pics d'intensité, et les lampes à Xénon, d'intensité plus homogène.
Combien de combinaisons sont possibles avec 5 fluorochromes pour le caryotype multifluorescence?
Trente-et-une combinaisons sont possibles, permettant de créer des sondes spécifiques pour les 23 paires de chromosomes.
Qui a développé le caryotype multifluorescence par superposition d'images (M-FISH)?
L'équipe de Speicher et al. en 1996, en utilisant des combinaisons de fluorochromes spécifiques à chaque chromosome.
Quel procédé d'analyse spectrale a été proposé pour le caryotype en couleurs (SKY-FISH)?
L'analyse par interférométrie, décrite par l'équipe de Schrock et al. en 1996 pour décomposer la lumière complexe.
De quoi dépend principalement la durée d'hybridation en FISH?
De la complexité et de la concentration de la sonde, variant de quelques minutes (centromères) à 48 heures (peintures).
Outre sa faible résolution, citez une limite de la CGH sur métaphase.
Elle ne détecte ni les anomalies équilibrées (translocations, inversions) ni les anomalies en faible mosaïque.
Quel ratio d'intensité patient/témoin indique une délétion en CGH?
Un ratio théorique de 0,5. Une trisomie est indiquée par un ratio de 1,5.
Quel est le nom du mélange d'ADN patient et témoin marqué en CGH-array?
La cible.
Quelle était la résolution des premières puces pangénomiques faites de clones BAC?
Une résolution moyenne d'une mégabase (Mb), soit 5 fois supérieure à celle du caryotype haute résolution.
Quelle technologie de puce à ADN permet une résolution de quelques centaines de paires de bases?
Les puces à oligonucléotides, où des millions de courtes séquences d'ADN (60-80 bases) sont fixées.
Quelle était l'application initiale des puces à SNP?
Elles étaient développées pour l'haplotypage et l'analyse de liaison génétique.
Dans quel domaine de la pathologie l'ACPA a-t-elle un impact diagnostique plus limité?
Dans les hémopathies malignes, où le caryotype et la FISH restent des examens de choix en routine.
Comment appelle-t-on une variation de l'ADN portant sur une seule paire de bases?
Un SNP (Single Nucleotide Polymorphism), réparti environ tous les 100 à 1000 paires de bases dans le génome.
Comment les premières méthodes de FISH révélaient-elles les sondes?
Via des haptènes (biotine, digoxigénine) reconnus par des anticorps ou de la streptavidine couplés à des fluorochromes.
Comment l'analyse chromosomique sur puce à ADN est-elle souvent désignée?
Par l'acronyme ACPA.
Fiche de révision
Lacytogénétique moléculaire a révolutionné l'exploration des anomalies chromosomiques, supplantant le caryotype traditionnel par des techniques plus résolutives.
Points Clés de la Cytogénétique Moléculaire
Généralités
- Cytogénétique Médicale en Révolution : Le caryotype (1956) n'est plus l'examen de première intention.
- ACPA (Analyse Chromosomique sur Puce à ADN) : Prend le relais depuis les années 1980.
- Résolution Supérieure : L'ACPA est10 à 1000 fois plus résolutive que le caryotype (5-10 Mb).
- Précision : Détermine taille et localisation d'un segment remanié pourles corrélations phénotype-génotype.
- Applications : Détection de pertes/gains de matériel chromosomique pour déficience intellectuelle, malformations congénitales, pathologies neuropsychiatriques.
- Rôle du Cytogénéticien : Devient un "interniste" de la pathologie génomique.
- Impact Limité dans les Cancers : Pour les hémopathies malignes, le FISH et la RT-PCR restent les examens de choix, avec le caryotype.
- Outil de Recherche : L'ACPA est précieux pour l'identification de gènes impliqués dans pathologies constitutionnelles et acquises.
I. Cytogénétique Moléculaire : Aspects Techniques
I.1. L'Hybridation inSitu Fluorescente (FISH)
La première technique de cytogénétique moléculaire, basée sur les propriétés de dénaturation et renaturation de l'ADN.
I.1.1. Historique
- 1981 : Équipe de David Ward développe la FISH, permettant de visualiser les loci sur chromosomes.
- Principe : Intégration d'un nucléotide par voie chimique et utilisation d'un microscope fluorescent.
- Aujourd'hui : Possibilité d'étudier simultanément plus de 20 loci.
I.1.2. Les Sondes
Fragments d'ADN de tailles variées, spécifiques de régions chromosomiques.
- Sondes d'ADN Répété :
- Taille : Moins de 1000 paires de bases (1 kilobase).
- Cible : Séquences répétées en tandem (ex: centromères).
- Signal : Ponctuel et de forte intensité.
- Sondes de Séquences Uniques :
- Spécifiques de loci ou de bras chromosomiques entiers.
- Sondes Spécifiques de Loci :
- Utilisation de BAC (bacterial artificial chromosome) de 100-200 kb.
- Autres vecteurs : fosmides, cosmides, phages, plasmides, chromosomes artificiels de levures(YAC).
- Sondes de Peinture Chromosomique :
- Ensemble de fragments d'ADN représentant un chromosome entier.
- Permettent d'hybrider une paire chromosomique donnée.
I.1.3. Le Marquage
Introduction de fluorochromes dans un fragment d'ADN.
- Ancien procédé (années 1980) :Nucléotides (d'UTP) couplés à des haptènes (digoxigénine, biotine) puis révélés par anticorps/streptavidine couplés à des fluorochromes.
- Actuel : Fluorochromes directement fixés sur les nucléotides.
- Procédés d'incorporation :
- Random priming et nick translation.
- Fluorochromes : Molécules excitable à une longueur d'onde (λexc) et émettant à une autre (λém).
- Fluorochromes couramment utilisés :
- DAPI (310 nm-372nm) : Se fixe sur les régions riches en AT, colore tous les chromosomes.
- FITC (λexc 495nm - λem 519 nm) : Fluoresce en vert.
- Cyanine 3 (CY3) (λexc 495nm - λem 519 nm) : Fluoresce en orange.
- Texas Red (λexc 589 nm - λem 615 nm) : Fluoresce en rouge.
- Cyanine 5 (λexc 650 nm - λem 670 nm) : Fluoresce en infra-rouge.
- Cyanine 5,5 (λexc 675 nm - λem 694 nm) : Fluoresce en infra-rouge.
I.1.4. La Multofluorescence
Permet l'étude simultanée de plusieurs loci.
- Principe : Utilisation de sondes marquées avec différents fluorochromes sans chevauchement spectral.
- Possibilité de marquer une sonde avec plusieurs fluorochromes pour unefluorescence complexe, analysée numériquement.
- Avec 5 fluorochromes, 31 combinaisons possibles permettent de construire 23 sondes de peinture pour le caryotype en multifluorescence.
I.1.5. L'Hybridation
Rencontre de la sonde dénaturée et de l'ADN chromosomique dénaturé.
- Efficacité : Dépend du temps d'hybridation et de la concentration de la sonde.
- Durée : 5 min (sondes centromériques) à 24-48h (sondes de peinture).
- Hybridation Compétitive :
- L'ADN contient 45%de séquences répétées et 65% de séquences uniques.
- Pour éviter les signaux aspécifiques des séquences répétées, Legoer et al. (1986) ajoutent un excès d'ADN non marqué riche en séquences répétées(Cot 1).
I.1.6. La Microscopie en Épifluorescence
Visualisation des fluorochromes excités.
- Principe Général :
- Source lumineuse (lampes à mercure/xénon) émet de la lumière blanche.
- Le filtre d'excitation sélectionne une λexc.
- Le miroir dichroïque réfléchit la λexc versla préparation.
- Le fluorochrome excité émet une λem d'intensité plus faible.
- La λem traverse le miroir dichroïque et le filtre d'émission (élimine les longueurs d'ondes parasites).
- La λem est transmise aux oculaires ou à une caméra pour numérisation.
- La Multofluorescence :
- Développement des caryotypes en multifluorescence grâce aux sondes multi-marquées et aux caméras numériques.
- Deux Procédés :
- Numérisation Successive :
- La caméra capture successivement les signaux des différentes sondes.
- Ex: Première image souvent générée par DAPI.
- Superposition des signaux pour étude précise des loci.
- Speicher et al. (1996) ont établi un caryotype en multifluorescence avec 23 sondes de peinture et un logiciel.
- Analyse Spectrale :
- Méthode plus complexe avec un interféromètre pour décomposer et analyser le contenu en longueur d'onde de la lumière.
- Décrit en 1996 par Schrock et al.
- Numérisation Successive :
I.1.7. Limites de la Technique FISH
- Sondes Spécifiques de Loci : Technique ciblée, n'explore pas l'ensemble du génome comme le caryotype.
- Sondes de Peinture :
- Résolution : 1,5 Mb pour la détection des translocations télomériques.
- Non utiles pour déterminer la région lors d'insertions chromosomiques.
- Pas d'une grande utilité pour la détection des délétions.
I.2. L'Hybridation Génomique Comparative sur Réseau d'ADN (CGH-array)
I.2.1. Historique et Principe de la CGH (sur métaphase)
- 1992 : Équipe de Dan Pinkel développe laCGH.
- Principe : Comparaison du nombre de molécules d'ADN de deux individus (patient vs. témoin) marqués par des fluorochromes différents et hybridés sur des métaphases d'un témoin.
- Analyse : Numérisation des signaux,calcul du ratio d'intensité patient/témoin.
- Ratio d'Intensité :
- Proche de 1 : Nombre de molécules identique.
- 0,5 : Délétion.
- 1,5 : Trisomie.
- Avantage : S'affranchit de l'analyse morphologique des chromosomes, analyse le contenu global en ADN.
- Limites de la CGH sur métaphase :
- Détecte uniquement les déséquilibres génomiques.
- Ne détecte pas les anomalies chromosomiques équilibrées ni les anomalies en faible mosaïque.
- Résolution : Cellede la bande chromosomique (5-10 Mb).
I.2.1. Version Améliorée : CGH-array ou ACPA
- Fin des années 1990 : Solinas-Toldo et Pinkel et al. transfèrent la CGH sur des lames avec des fragments d'ADN fixés ("sondes").
- Microarray ou Puce à ADN : Support physique avec des séquences génomiques fixes.
- Processus :
- Même quantité d'ADN témoin et ADN patient (marqués différemment) est déposée sur la lame.
- Calcul du rapport d'intensité de fluorescence au niveau de chaque sonde.
- Logiciels dédiés pour le traitement statistique des données.
- Résultats graphiques : Chaque "point" représente le ratio d'intensité d'une sonde, placés sur les idéogrammes des chromosomes.
- Détection des Déséquilibres :Se fait par la déviation du ratio d'intensité de fluorescence au niveau des sondes, non plus des bandes chromosomiques.
- Résolution : Dépend du nombre et de la localisation des sondes.
- Premières "puces pangénomiques" : 3000 clones BAC/PAC, résolution moyenne de 1 Mb (5 fois supérieure au caryotype haute résolution).
- Ishkanian et al. : 32433 BAC chevauchants, résolution de 30 Kb.
- Milieu des années 2000 : Puces à oligonucléotides (60-80 bases), plusieurs millions d'oligonucléotides, résolution de quelques centaines de paires de bases.
- CNV (Copy Number Variation) : Déséquilibre génomique de plus de 1 Kb détecté par CGH-array.
I.2.1. Une Variante : Les Puces à SNP
- SNP (Single Nucleotide Polymorphism) : Variations sur une seule paire de base, distribuées uniformément (10 millions de SNP, 1 tous les 100-1000 pb).
- Oligonucléotides surlame : Possibilité de fixer des oligonucléotides contenant des SNP, avec les deux allèles pour un locus donné.
- Avantages des Puces SNP :
- Détection des isodisomies uniparentales (perte d'hétérozygotie).
- Possibilité de déterminer l'origine parentale d'un remaniement avec l'étude des parents.
- Détection de Perte d'Hétérozygotie : Si un seul allèle estdétecté.
- Autres applications : Initialement pour l'haplotypage et l'analyse de liaison, mais donnent aussi des informations sur le nombre de copies d'ADN.
- Automatisation : Ces techniques sont entièrement automatisables, permettant l'étude des déséquilibres génomiques à haut débit.
- ACPA : L'acronyme désigne à la fois la CGH-array et les puces à SNP.
Note: Les images mentionnées dans le texte source n'ont pas été reproduitesici.
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Combien de combinaisons sont possibles en utilisant 5 fluorochromes pour construire des sondes de peinture ?
Combien de loci peuvent être étudiés simultanément sur des chromosomes grâce aux progrès de la FISH ?
Comment appelle-t-on l'ensemble des fragments d'ADN représentant un chromosome entier et utilisés comme sonde ?
Quel fluorochrome se fixe sur les régions riches en AT de l'ADN et est appliqué directement sur les préparations chromosomiques pour colorer tous les chromosomes ?
En quelle année les travaux de l'équipe de David Ward ont-ils permis de visualiser directement sur des chromosomes la localisation de la sonde, donnant naissance à la FISH ?
Quels sont les deux types de sondes distingués pour la FISH ?
Quelle est l'excitation et l'émission du FITC (fluorescein isothiocyanate) ?
Quel est le processus qui permet d'introduire des fluorochromes dans un fragment d'ADN ?
Quelle est la taille des sondes composées de séquences spécifiques d'ADN répété ?
Qui a décrit le procédé d'analyse spectrale des signaux en multifluorescence en 1996 ?
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