Structure et spécificité des enzymes : site actif

Généralités sur l'Enzymologie

L'enzymologie étudie les enzymes, des protéines essentielles à la vie qui catalysent les réactions chimiques. Ces réactions se caractérisent par leur rapidité, leur déroulement à basse température (0-45°C) et leur spécificité.

Définition des Enzymes

• Une enzyme est une protéine dotée de propriétés catalytiques (à l'exception des ribozymes).

• Les enzymes sont des catalyseurs : elles augmentent la vitesse des réactions chimiques sans en modifier le résultat final et sans être altérées à la fin de la réaction.

• Chaque enzyme est spécifique d'une réaction, catalysant toujours la même transformation sur les mêmes substrats.

• Elles sont synthétisées par les êtres vivants, leur production étant déterminée génétiquement.

Exemple : L'Anhydrase Carbonique

L'anhydrase carbonique (PM = 29 kDa, 264 acides aminés, nécessite du Zinc) catalyse la réaction réversible :

CO₂ + H₂O ⇌ H₂CO₃ ⇌ HCO₃⁻ + H⁺

Elle catalyse la réaction d'addition d'une molécule d'eau sur une molécule de gaz carbonique pour donner l'acide carbonique qui se dissocie au pH physiologique en un ion bicarbonate et un proton. Cette réaction est réversible et aboutit à un état d'équilibre que la catalyse enzymatique ne change pas

Cette enzyme accélère l'atteinte de l'équilibre sans le modifier.

Substrat et Produit

• Substrat : Molécule(s) qui entre(nt) dans une réaction enzymatique et est/sont définitivement modifiée(s) par l'action catalytique.

• Produit : Nouvelle molécule qui résulte d'une réaction catalysée par une enzyme.

• Dans une réaction réversible, le produit peut devenir substrat et vice-versa.

Cofacteur

• Un cofacteur est un corps chimique (atome ou molécule) parfois indispensable à une réaction enzymatique.

• Il participe à la réaction mais n'est pas transformé définitivement. Il peut transporter le substrat, recevoir le produit ou participer à la structure de l'enzyme.

• L'enzyme reconnaît spécifiquement les cofacteurs dont elle a besoin.

Spécificité des Réactions Enzymatiques

Spécificité de Réaction

Une enzyme catalyse une seule des réactions thermodynamiquement possibles pour un substrat donné. Par exemple, un acide aminé peut être décarboxylé ou transaminé, mais chaque réaction sera catalysée par une enzyme différente.

Spécificité de Substrat

Une enzyme n'agit pas sur tous les substrats mais préférentiellement sur un ou quelques-uns. Le site actif reconnaît la structure spécifique du substrat.

• Stéréospécificité : Une enzyme peut reconnaître uniquement un énantiomère (ex: acide aminé de la série L ou D).

Énergie d'Activation (ΔG‡ activation)

• C'est l'énergie requise pour que la réaction ait lieu, permettant de rompre les liaisons du substrat.

• Lors de l'absorption de cette énergie, la vitesse et la fréquence des collisions entre molécules augmentent, fragilisant les liaisons.

• L'état de transition est l'état le plus énergétique et instable, où la réaction peut avoir lieu.

• Les enzymes abaissent l'énergie d'activation, augmentant ainsi la vitesse de réaction sans modifier la variation d'énergie libre de Gibbs de la réaction (ΔG réaction = G produits - G substrats).

• Cette barrière d'activation est cruciale pour la vie, empêchant la décomposition spontanée des macromolécules.

Structure et Spécificité des Enzymes

Notion de Site Actif

• L'activité enzymatique est liée à la présence d'un site actif dans la structure de l'enzyme, ayant la forme d'une cavité ou d'un sillon.

• Le substrat se fixe dans le site actif par des interactions spécifiques avec la surface de la cavité, ce qui l'oriente pour favoriser la réaction.

• Les groupements fonctionnels de certains résidus d'acides aminés dans le site actif peuvent participer à la réaction (résidus catalytiques).

• Le site actif comprend deux parties :

  • Un site de fixation (ou de reconnaissance) du substrat.

  • Un site catalytique responsable de la réaction chimique.

Conformation du Site Actif

Plusieurs modèles expliquent la fixation du substrat :

1. Modèle "Clé-Serrure" (Fischer) :

   • Hypothèse d'une complémentarité de forme préexistante entre le substrat et le site actif.

   • Modèle statique, sans déformation du substrat ni de l'enzyme lors de la fixation.

2. Modèle de l'Ajustement Induit (Koshland) :

   • Implique des modifications conformationnelles de l'enzyme lors de l'association avec le substrat.

   • Ces déformations optimisent l'orientation des groupes catalytiques et ajustent le site actif.

   • Modèle dynamique où l'énergie d'interaction contribue à rendre l'enzyme active.

3. Modèle de la Sélection Conformationnelle :

   • Postule un équilibre préexistant entre différentes conformations de l'enzyme.

   • Le substrat se fixe préférentiellement à une conformation spécifique, déplaçant l'équilibre vers la forme active.

   • Modèle dynamique, où la déformation précède l'interaction avec le ligand.

Éléments de Cinétique Enzymatique

Vitesse de Réaction

La vitesse de réaction représente le nombre de moles de substrat transformées en produit par unité de volume et de temps. Elle est mesurée par la variation des concentrations de substrat ou de produit au cours du temps.

Phases de la Réaction

La réaction enzymatique suit plusieurs étapes :

1. Formation du complexe Enzyme-Substrat (ES) : E + S ⇌ ES.

2. Transformation en complexe Enzyme-Produit (EP) : ES ⇌ EP.

3. Dissociation du complexe EP : EP ⇌ E + P.

Le déroulement de la réaction n'est pas uniforme :

• Phase initiale très brève : Vitesse croissante, formation du complexe ES.

• Phase stationnaire : Vitesse maximale et constante (vitesse initiale), toutes les enzymes sont occupées par le substrat.

• Phase tardive : La vitesse diminue à mesure que la concentration du produit augmente et que la réaction inverse concurrence.

• Phase d'équilibre : La vitesse de la transformation inverse égale celle de départ, les concentrations ne changent plus.

Vitesse Initiale (Vi)

• C'est la vitesse constante mesurée durant la phase stationnaire.

• Elle correspond au moment où le rapport [ES]/[E total] est maximal, assurant l'efficacité catalytique la plus grande.

• Dans ce cours, la vitesse étudiée est toujours la vitesse initiale.

Effet de la Concentration de l'Enzyme ([E])

La vitesse initiale est directement proportionnelle à la concentration de l'enzyme, tant que le substrat est en excès.

Effet de la Concentration de Substrat ([S])

La vitesse initiale augmente avec la concentration du substrat, mais de manière non linéaire, tendant vers une valeur maximale (Vmax).

Cinétique Michaelienne

• La relation entre la vitesse initiale (v) et la concentration du substrat ([S]) est hyperbolique.

• Vmax (Vitesse maximale) : Vitesse théorique atteinte lorsque la concentration du substrat est infinie et que toutes les enzymes sont saturées.

• Km (Constante de Michaelis) : Concentration de substrat pour laquelle la vitesse initiale est égale à la moitié de la Vmax (v = Vmax/2).

• Km est inversement proportionnelle à l'affinité de l'enzyme pour le substrat.

Équation de Michaelis-Menten

L'équation qui décrit la cinétique enzymatique est :

v = Vmax * ([S] / (Km + [S]))

Cette équation permet de définir la vitesse initiale en fonction de [S], Vmax et Km.

Interprétation des Paramètres Cinétiques

• Vmax : Vitesse maximale théorique.

• Km : Concentration de substrat à laquelle la vitesse initiale est la moitié de Vmax.

Détermination Expérimentale de Km et Vmax

Ces paramètres sont déterminés graphiquement à partir de mesures expérimentales :

• Représentation de Lineweaver et Burke (double inverse) :

  • Trace 1/v en fonction de 1/[S].

  • Obtient une droite dont l'ordonnée à l'origine est 1/Vmax et l'abscisse à l'origine est -1/Km.

• Représentation de Eadie-Hofstee :

  • Trace v en fonction de v/[S].

  • Obtient une droite dont l'ordonnée à l'origine est Vmax et la pente est -Km.

Facteurs Influencant l'Activité Enzymatique

Effets du pH

Le pH influence l'activité enzymatique de deux manières :

1. Dénaturation :

   • Un pH défavorable peut altérer la structure secondaire et tertiaire de l'enzyme, entraînant une perte d'activité.

   • L'activité résiduelle diminue si l'enzyme est conservée à un pH non optimal.

2. Charges Électriques du Site Actif :

   • Le pH modifie l'état d'ionisation des radicaux d'acides aminés du site actif (COOH/COO⁻, NH₃⁺/NH₂).

   • Il existe un pH optimum où les charges électriques sont les plus favorables à la liaison enzyme-substrat.

L'activité enzymatique est maximale au pH optimum et nulle en dehors de certaines valeurs (pH d'arrêt).

• Exemple : La pepsine (estomac) a un pH optimum très acide, tandis que l'amylase et la trypsine (duodénum) ont un pH optimum plus alcalin.

Effets de la Température

La température a deux effets superposés sur la vitesse de réaction :

1. Activation :

   • À des températures inférieures à l'optimum (généralement < 40-45°C), la chaleur apporte de l'énergie qui facilite la réaction.

   • Le Q₁₀ mesure l'activation de l'enzyme par une augmentation de 10°C.

   • La relation d'Arrhénius décrit la relation entre la vitesse de réaction et la température (log(v) inversement proportionnel à 1/T) pour les températures non dénaturantes.

2. Dénaturation :

   • Au-delà d'une température optimale (ex: 45°C), la chaleur dénature les structures secondaires et tertiaires de l'enzyme, entraînant une perte rapide d'activité.

Cofacteurs

Les cofacteurs sont souvent indispensables au déroulement de la réaction enzymatique.

• Une enzyme inactive sans son cofacteur est une apoenzyme.

• L'enzyme complète avec son cofacteur est une holoenzyme.

• Les cofacteurs sont classés en deux catégories :

  • Ions métalliques (ex: Zn²⁺, Mg²⁺, Ni²⁺).

  • Coenzymes : Molécules organiques (souvent des vitamines ou leurs dérivés).

    • Faiblement liés à l'enzyme (liaisons hydrogène ou ioniques).

    • Groupements prosthétiques : Fortement liés par liaison covalente.

Unités d'Activité Enzymatique

• UI (Unité Internationale) : Quantité d'enzyme catalysant 1 µmol de substrat par minute.

• Katal (kat) : Quantité d'enzyme (en mole) catalysant une mole de substrat par seconde (mol·s⁻¹). Le microkatal (10⁻⁶ kat) est souvent utilisé.

• Activité spécifique : Quantité de substrat métabolisé par unité de temps et par mg de protéine (ex: mmol·s⁻¹·mg⁻¹).

• Activité absolue : Quantité de substrat métabolisé par une enzyme en une unité de temps.

Nomenclature des Enzymes (Numéros EC)

La classification numérique (Enzyme Commission numbers, EC) est basée sur la réaction chimique catalysée. Chaque numéro EC est associé à un nom recommandé.

• Les 4 nombres de la nomenclature EC désignent :

  1. Le type de réaction catalysée.

  2. Le substrat général impliqué.

  3. Le substrat spécifique impliqué.

  4. Le numéro de série de l'enzyme.

Classes Principales (Niveau Supérieur)

1. EC 1 Oxydo-réductases : Catalysent les réactions d'oxydoréduction (ex: oxygénases, lactate déshydrogénase qui utilise le NAD⁺ comme coenzyme).

2. EC 2 Transférases : Transfèrent un groupement fonctionnel (ex: groupe méthyle, phosphate). Nécessitent souvent un coenzyme (ex: alanine aminotransférase qui utilise le phosphate de pyridoxal).

3. EC 3 Hydrolases : Catalysent l'hydrolyse de diverses liaisons (l'eau est l'accepteur du groupe transféré). Ex: protéases comme la trypsine, qui hydrolyse les liaisons peptidiques.

4. EC 4 Lyases : Brisent diverses liaisons par des procédés autres que l'hydrolyse ou l'oxydation, formant souvent une nouvelle liaison double ou un cycle (ex: adénylate cyclase qui transforme l'ATP en AMPc). Elles ne nécessitent qu'un réactif dans le sens direct.

5. EC 5 Isomérases : Catalysent les réactions d'isomérisation au sein d'une seule molécule (ex: phosphoglucomutase qui déplace un groupe phosphate).

6. EC 6 Ligases : Joignent deux molécules par des liaisons covalentes, avec apport d'énergie d'un nucléoside triphosphate (ex: ATP). Ex: glutamine synthétase.

Isoenzymes (Isozymes)

• Les isoenzymes sont des enzymes qui catalysent la même réaction chimique mais possèdent une séquence d'acides aminés différente.

• Elles peuvent être issues de gènes différents ou avoir des compositions en sous-unités différentes.

• Exemple : La lactate déshydrogénase (LDH) catalyse l'oxydation du L-lactate en pyruvate. Elle existe sous forme de cinq isoenzymes tétramériques, composées de sous-unités H et M.

• Les différentes isoenzymes de la LDH sont présentes en proportions variables selon les tissus (ex: LDH1 et LDH2 dans le cœur, LDH4 et LDH5 dans le foie et les muscles).

• Leur dosage sérique est utilisé en diagnostic pour identifier des lésions tissulaires spécifiques (ex: augmentation de LDH1 dans l'infarctus du myocarde).