Méthodes analytiques en biologie clinique (Mélanie closset ) 

Introduction à la Biochimie Médicale et aux Méthodes Analytiques

La biochimie médicale, enseignée par le Dr Mélanie Closset du Laboratoire de biochimie médicale du CHU UCL Namur, site Godinne, est une discipline essentielle qui s'appuie sur une variété de méthodes analytiques sophistiquées pour comprendre et diagnostiquer les processus biologiques dans le corps humain. Ces techniques permettent la détection et la quantification de biomolécules, offrant des informations cruciales pour le suivi de la santé et la détection des maladies. Ce document explore en détail les principales méthodes analytiques utilisées en biologie clinique.

Potentiométrie : Mesure Électrochimique des Ions

La potentiométrie est une technique électrochimique qui mesure la différence de potentiel électrique entre deux électrodes dans une cellule électrochimique. Elle évalue passivement le potentiel généré en solution, sans passage de courant significatif. * Principe de fonctionnement : * Une électrode de référence maintient un potentiel constant et connu. * Une électrode de travail (ou indicatrice) voit son potentiel varier en fonction de la composition ionique de l'échantillon. * La différence de potentiel mesurée entre ces deux électrodes est directement liée à l'activité ionique de la substance en solution. * Cette activité ionique est ensuite convertie en concentration pour les électrolytes (par exemple, sodium, potassium, chlore). * Électrodes spécifiques : * L'électrode à membrane de verre est l'exemple classique des pH-mètres. * Pour les ions tels que , et , des électrodes ion-sélectives sont utilisées. Chaque électrode produit un potentiel électrique en réponse à l'activité spécifique de l'ion qu'elle est conçue pour détecter. * Le potentiel d'une électrode de travail est donné par l'équation de Nernst : , où est le potentiel de l'électrode, le potentiel standard, la constante des gaz parfaits, la température, le nombre d'électrons échangés, la constante de Faraday et le quotient réactionnel.

Potentiométrie Directe vs. Indirecte

Il existe deux approches principales en potentiométrie en biochimie clinique, se distinguant principalement par la gestion de l'échantillon : * Mesure Potentiométrique Directe : * Mesure directe des électrolytes dans l'échantillon (plasma, sang total, sérum). * Aucune dilution préalable n'est effectuée avant la mesure. * Utilisée dans les analyseurs des gaz du sang (qui mesurent souvent , , , pH) et certains automates de chimie sèche (pour urines et liquides de ponction). * L'avantage est la rapidité et la minimisation des erreurs de dilution. * Mesure Potentiométrique Indirecte : * Comporte une étape de dilution préalable de l'échantillon avant la mesure de la concentration. * Cette dilution est cruciale pour réduire les interférences (par exemple, dues aux protéines ou aux lipides dans l'échantillon). * Utilisée dans les automates multiparamétriques de biochimie pour le plasma, le sérum, les urines, et les liquides de ponction. * Permet une mesure plus précise de la concentration en ions. * L'article de Siggard-Anderson (1986) est cité comme référence pour l'électrochimie.

Spectrophotométrie d'Absorbance UV : Analyse par la Lumière

La spectrophotométrie est une technique optique d'absorbance UV qui permet de déterminer l'absorbance d'une solution à une longueur d'onde spécifique. Son nom signifie littéralement "mesure des photons en fonction du spectre". * Principe : * Une lumière monochromatique d'intensité connue () est dirigée à travers une cuve contenant la solution à analyser. * L'intensité de la lumière transmise () est mesurée après son passage à travers la solution. * L'absorbance () est calculée selon la formule : . * Loi de Beer-Lambert : * Dans des conditions idéales, l'absorbance est directement proportionnelle à la concentration et au trajet optique : . * : absorbance (sans unité). * : coefficient d'absorption molaire (), caractéristique de l'espèce absorbante à une longueur d'onde donnée et qui traduit sa probabilité d'absorption d'un quantum de lumière. * : concentration de l'espèce absorbante (). * : trajet optique (épaisseur de la cuve, en cm). * Conditions idéales pour l'application de la loi : * Lumière incidente monochromatique. * Absence de fluorescence (l'échantillon ne doit pas ré-émettre de lumière). * Échantillon homogène. * Concentration de la substance absorbante pas trop élevée (pour éviter les déviations à la loi). * Applications en laboratoire : * Dosage : Calcul de la concentration d'un analyte dans une solution (ex: Calcium). * Dosage cinétique : Observation de la cinétique d'une réaction chimique, souvent enzymatique, par la variation de l'absorbance. Cela permet de convertir la variation d'absorbance en activité enzymatique (ex: LDH). * Cette technique est très répandue et intégrée dans les automates multiparamétriques de biochimie (ex: Architect®/Aeroset®, cobas® de Roche/Hitachi).

Exemple d'Application : Dosage de la Lactate Déshydrogénase (LDH) et du Calcium

* Dosage de la LDH : * La LDH est une enzyme largement distribuée dans les tissus (coeur, foie, muscles, reins). * Des niveaux sériques élevés de LDH sont observés dans diverses pathologies (anémie mégaloblastique, carcinome disséminé, choc, maladies musculaires, etc.). * Méthodologie (UV-assay) : La méthode est basée sur la formulation de l'IFCC et optimisée pour la performance. * Réaction enzymatique : . * La LDH catalyse la conversion du L-lactate en pyruvate, réduisant simultanément le en . * Le taux initial de formation de est directement proportionnel à l'activité catalytique de la LDH. * Le absorbe fortement à 340 nm. L'augmentation de l'absorbance à cette longueur d'onde est mesurée pour déterminer l'activité enzymatique. * Les réactifs comprennent du N-méthylglucamine, du lactate de lithium (R1) et du (R2), avec stabilisants et conservateurs. La qualité des réactifs est primordiale, avec des précautions pour éviter l'absorption de par R1 (utilisation de "cheminées" colorées). * Dosage du Calcium : * Le calcium est majoritairement présent dans les os, mais les ions calcium sériques ont des fonctions vitales (excitabilité neuromusculaire, coagulation sanguine, activation enzymatique). * L'hypercalcémie (hyperparathyroïdie, hypervitaminose D, myélome multiple) et l'hypocalcémie (hypoparathyroïdie, stéatorrhée, néphrose) sont des indicateurs de diverses pathologies. * De nombreuses méthodes ont été développées, telles que la photométrie de flamme, la précipitation oxalique, la spectrophotométrie d'absorption atomique, la chélation EDTA. * Méthodologie actuelle : Utilisation de complexes de colorants calcium. La méthode utilise le colorant Arsenazo III qui réagit avec le calcium en solution acide pour former un complexe bleu-pourpre. * La couleur développée est mesurée à 660 nm et est proportionnelle à la concentration de calcium dans l'échantillon.

Spectrophotométrie de Réflectance

La spectrophotométrie de réflectance mesure la proportion de lumière réfléchie par la surface d'un matériau. Contrairement à l'absorbance qui mesure la lumière transmise, la réflectance est une technique de mesure indirecte. * Applications : * Chimie sèche : Largement utilisée dans les bandelettes réactives où des réactifs sont imprégnés sur un support sec. * Lecture automatisée de bandelettes urinaires : Les changements de couleur sur les bandelettes réactives sont lus par réflectance pour déterminer la présence et la concentration de divers analytes urinaires.

Techniques Immunologiques : Réaction Antigène-Anticorps

Ces techniques sont basées sur la réaction spécifique entre un antigène (Ag) et un anticorps (Ac) in vitro, conduisant à la formation d'un immuncomplexe. Elles sont impliquées dans de nombreux secteurs de la biologie clinique et se divisent en détection directe et indirecte.

Détection Directe des Immunocomplexes

Ces méthodes détectent directement la formation de l'immuncomplexe sans nécessiter un procédé de révélation secondaire. * Principes de base : * Mélange d'anticorps en quantité suffisante avec un antigène soluble d'intérêt. * Formation de complexes immuns qui peuvent précipiter. * Attention à l'excès d'antigène qui peut inhiber la réaction de précipitation (effet Prozone ou phénomène de zone). * Types de réactions : * Réactions de précipitation : Formation d'agrégats d'Ag reliés par les Ac (ex: Immunodiffusion). * Réactions d'agglutination : Formation de larges agrégats visibles (ex: agglutination de globules rouges). * Immunocytolyse : Destruction de cellules via un processus immunologique. * Méthodes Qualitatives : Détectent la présence/absence ou un profil. * Phase solide (gélifié) : * Immunodiffusion double en gel (Ouchterlony) : Les Ag et Ac diffusent dans un gel, se rencontrent et forment une ligne de précipitation. * Électrosynérèse : Combinaison d'électrophorèse et d'immunodiffusion. * Immunoélectrophorèse : Séparation électrophorétique des protéines suivie d'une diffusion d'antisérums pour la formation de précipités. * Immunofixation (IMMUNOFICATION) : Technique de précipitation en deux temps pour révéler les immunoglobulines monoclonales, souvent après une séparation électrophorétique. Un échantillon est séparé électrophorétiquement sur plusieurs pistes, chaque piste étant ensuite incubée avec un immunosérum monospécifique. Après lavage et coloration, les précipités révèlent la nature du composé monoclonal (Ig G, A ou M, kappa ou lambda). * Phase liquide : * Test de précipitation en anneau (Ring Test) : Un antigène est superposé à un anticorps dans un tube, un anneau de précipité se forme à l'interface. * Méthodes Quantitatives : Mesurent la concentration des analytes. * Phase solide (gélifié) : * Immunodiffusion radiale (Manicini) : L'antigène diffuse à partir d'un puits dans un gel contenant l'anticorps, formant un anneau de précipitation dont le diamètre est proportionnel à la concentration de l'antigène. * Électro-immunoquantification. * Phase liquide : * Turbidimétrie : Mesure de la turbidité d'une solution par l'effet de transmission de la lumière incidente. Le signal est inversement proportionnel à la concentration de l'analyte dosé. Elle évalue la quantité de substance en suspension résultant de la précipitation. Les phénomènes physiques sont la diffusion, l'absorption et la réflexion de la lumière. La turbidimétrie est plus performante en excès d'anticorps mais moins sensible que la néphélémétrie. L'utilisation de billes de latex peut augmenter sa sensibilité. * Néphélémétrie : Mesure de la turbidité d'une solution par l'effet de diffusion de la lumière incidente. Un faisceau diffracté est mesuré par densité optique dans une cellule photoélectrique. Le signal est proportionnel à la concentration de l'analyte dosé. Plus sensible que la turbidimétrie, elle est utilisée pour le dosage de petites protéines spécifiques. * Applications : * Turbidimétrie : Automates multiparamétriques de biochimie (Ex: Vitros 5600®, Alinity c®) pour le dosage d'Ig A/M/G, haptoglobine, transferrine. * Néphélémétrie : Automates dédiés (Optilite®, BN Prospec®, Image®) pour le dosage de céruloplasmine, chaînes légères kappa et lambda libres sériques.

Détection Indirecte : Nécessite un Procédé de Révélation

Ces méthodes ne détectent pas directement l'immuncomplexe, mais nécessitent un marqueur qui sera révélé par un second processus. Elles sont généralement plus sensibles et spécifiques. * Deux stratégies principales : * Méthode Sandwich (ou immuno-captation) : * Un anticorps est fixé à une phase solide (tube, puits, bille paramagnétique). * L'échantillon est déposé et l'antigène d'intérêt se fixe à l'anticorps (étape d'incubation). * Après lavages, un anticorps de révélation, couplé à un traceur (radio-isotope, enzyme, fluorochrome, substance luminogène), est ajouté et se fixe à un autre épitope de l'antigène. * Après de nouveaux lavages, le signal du traceur est détecté. * Le signal émis est directement proportionnel à la quantité d'antigène. Cette méthode est très spécifique et sensible car elle nécessite la reconnaissance de deux épitopes par l'antigène. * Nécessite un excès d'anticorps pour une liaison optimale. * Méthode par Compétition : * Un anticorps (ou antigène) est fixé à une phase solide. * L'échantillon et un antigène marqué (de même nature que l'antigène d'intérêt) sont ajoutés simultanément ou séquentiellement. * L'Ag d'intérêt de l'échantillon et l'Ag marqué entrent en compétition pour un nombre limité de sites de liaison sur l'anticorps fixé. * Après lavage, le signal du traceur est mesuré. * Le signal émis est inversement proportionnel à la quantité d'antigène présent dans l'échantillon. * Types de Traceurs utilisés dans les méthodes indirectes : * Radio-Immuno-Assay (RIA) : * Technique historique utilisant un isotope radioactif (ex: ) émetteur de rayonnement gamma ou bêta comme traceur. * Quantification par compteur gamma. * Avantages : très bonne sensibilité (dosages hormonaux, médicaments, marqueurs tumoraux), marquage facile. * Inconvénients : radioactivité (radioprotection, gestion des déchets, coûts). * Exemples actuels : dosage de la Gastrine, VIP. (Historique : Insuline ). * Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ou Enzyme Immuno Assay (EIA) : * Traceur : enzyme (ex: G6PD, peroxydase de raifort) qui catalyse la formation d'un produit coloré à partir d'un substrat chromogène. * Le marquage peut être direct ou indirect. * Quantification par spectrophotométrie à une longueur d'onde spécifique (ex: G6PD + / → /, lecture à 340 nm). * Avantages : facilité, polyvalence (phase solide/liquide), nombreuses applications (anticorps maladies infectieuses, auto-immunes, cytokines). * Inconvénient : l'automatisation intégrée peut être complexe pour certaines applications. * Immunofluorescence (IFA ou Immuno Fluoro Metric Assay) : * Traceur : fluorochrome (ex: isothiocyanate de fluorescéine (FITC)). * Le fluorochrome absorbe la lumière à une certaine longueur d'onde, excitant ses électrons. Lors du retour à l'état fondamental, il émet de la lumière fluorescente à une longueur d'onde plus importante. * Détection : observation au microscope à fluorescence (lumière UV) ou cytométrie en flux. * Types : * Directe (IFD) : Détection d'antigènes sur coupes tissulaires (immunophénotypage cellulaire pour compter les cellules marquées). * Indirecte (IFI) : Recherche d'anticorps immuns ou auto-immuns dans un liquide biologique (technique de choix pour le diagnostic des maladies auto-immunes). Un immunosérum anti-immunoglobulines humaines marqué par un fluorochrome est utilisé pour détecter et titrer les anticorps dans l'échantillon. * Chimioluminescence (CLIA/ECLIA) : * Émission de lumière lors d'une réaction chimique. * Traceur : substance oxydante qui déclenche l'excitation d'un substrat luminogène, lequel libère de la lumière en retrouvant son état fondamental. * Détection : lecture de l'intensité lumineuse (Relative Light Unit), proportionnelle à la concentration de l'antigène. * Exemple : Anticorps conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) qui catalyse l'oxydation d'un dérivé du luminol. * Avantages : excellentes performances analytiques, technique automatisée. * Inconvénient : interférences possibles. * Autres méthodes indirectes : Western Blot, Dot Blot.

Considérations Générales pour les Immuno-dosages

* Spécificité de l'anticorps : Cruciale pour des résultats fiables. * Suivi des performances : Essentiel pour maintenir la qualité des dosages. * Homogène/Hétérogène : Distinction entre essais où les étapes de séparation et de lavage des complexes sont ou non nécessaires. * Interférences : * Exogènes : Hémolyse, lipidémie, ictère qui peuvent fausser la lecture due à la couleur ou à la turbidité de l'échantillon. Effet de matrice (différences entre l'échantillon patient et les calibrateurs). * Endogènes : Excès d'antigène (effet crochet ou prozone), interférence avec des anticorps hétérophiles (anticorps dirigés contre des Ig d'autres espèces, ex: souris, lapin) présents chez le patient. * Absence de standardisation : Peut être un problème entre différents laboratoires ou kits pour les valeurs de référence.

Électrophorèse : Séparation par Champ Électrique

L'électrophorèse (du grec "electrum" pour électricité et "phorein" pour porter) est une méthode qui sépare les constituants ionisés d'une solution en les soumettant à un champ électrique. * Principe : * Fractionnement des constituants (protéines, acides nucléiques) d'une solution sous l'effet d'un champ électrique. * La migration des molécules dépend de leur charge électrique (q), de leur taille (rayon r), du pH du milieu, du support utilisé, du voltage appliqué et de la température. * Les molécules migrent de la cathode (-) vers l'anode (+), en fonction de leur densité de charge (rapport charge/rayon hydrodynamique équivalent, ). * Étapes Générales : * Application de l'échantillon sur un support. * Soumission à un champ électrique. * Migration des molécules. * Coloration/Décoloration des fractions séparées. * Lecture/Quantification par densitométrie pour évaluer le pourcentage des différentes fractions et calculer les concentrations relatives.

Types d'Électrophorèse

Électrophorèse en veine liquide	Électrophorèse sur support	Électrophorèse Capillaire
	Électrophorèse de zone (ex: protéines sériques)	Électrophorèse capillaire en zone
	Focalisation isoélectrique	Électrophorèse capillaire micellaire
	Électrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE)	Focalisation isoélectrique capillaire
	Blotting (ex: Western Blot après électrophorèse)	Électrophorèse capillaire en gel

Applications Spécifiques de l'Électrophorèse

* Électrophorèse des protéines sériques : * Permet d'évaluer la distribution des protéines sériques, fournissant une approche qualitative d'abord, puis quantitative. * Les résultats sont exprimés en pourcentages des différentes fractions et peuvent être convertis en concentrations absolues si la protéinémie totale est connue. * Un profil d'électrophorèse normal des protéines sériques typique : * Albumine (55.0 - 67.0%) * Alpha 1 (2.7 - 5.5%) : Alpha 1 Antitrypsine, Alpha 1 Glycoprotéine acide, Alpha 1 Lipoprotéines. * Alpha 2 (6.7 - 11.3%) : Haptoglobine, Céruloplasmine, Alpha 2 Macroglobuline, Alpha 2 lipoprotéines. * Bêta (9.0 - 13.6%) : Transferrine, Hémopexine. * Gamma (11.6 - 17.6%) : Ig G, A, M, D, E, CRP. * Toute altération quantitative ou qualitative de ce tracé peut indiquer diverses affections. * Immunofixation : * Indiquée en cas de suspicion de composé monoclonal à l'électrophorèse des protéines sériques. * L'échantillon dilué subit une électrophorèse, puis est incubé avec des antisérums spécifiques. * La migration se fait de la cathode (-) à l'anode (+). * Utilisation d'antisérums monospécifiques sur chaque piste pour identifier la nature du composé monoclonal (ex: Ig G, A ou M, kappa ou lambda). La révélation se fait par coloration (ex: amidoschwartz). * Électrophorèses de l'hémoglobine : * Utilisées pour la révélation de fractions d'hémoglobine variante. * Réalisées à pH alcalin ou acide. * Permettent l'identification de variantes homozygotes ou hétérozygotes (ex: HbS, HbC, Thalassémies). * Électrophorèse capillaire (ex: Capillarys 3 OTCA, SEBIA®) : * Séparation des protéines en fonction de leur charge, de leur taille et du flux d'électroendosmose, à des voltages élevés et dans un tampon alcalin. * Utilise généralement plusieurs capillaires de silice (ex: 8 capillaires). * Les parois des capillaires sont chargées négativement, et la solution tampon interne est chargée positivement, créant une différence de potentiel. * Les protéines sont entraînées vers la cathode. Les protéines "les moins chargées négativement" migrent en premier. * Détection des protéines par absorbance UV. * Application : Détection de la transferrine carbo-hydrate déficiente (CDT), utilisée comme marqueur de consommation chronique d'alcool.

Chromatographie : Séparation par Affinité Différentielle

La chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les différences d'affinités des substances à analyser à l'égard de deux phases: une phase stationnaire (PS) et une phase mobile (PM). * Principe : * Une phase mobile transporte l'échantillon à travers une phase stationnaire. * Les composants de l'échantillon interagissent différemment avec la PS et la PM en fonction de leurs propriétés physico-chimiques. * L'affinité relative de chaque composé pour la phase stationnaire et la phase mobile est différente, ce qui entraîne des temps de rétention spécifiques. * Coefficient de partage : Décrit la répartition d'un soluté entre la phase stationnaire et la phase mobile : . * L'objectif est l'identification et la quantification des analytes.

Phases en Chromatographie

* Phase Stationnaire (PS) : * Peut être solide (colonne, couche mince) ou liquide (imprégnant un support solide, ou chaîne carbonée greffée sur un support). * Pour la chromatographie liquide haute performance (HPLC), la PS est un support poreux recouvert d'un gel (liquide greffé) choisi pour retenir les molécules d'intérêt, souvent avec une granulométrie fine. * Phase Mobile (PM) : * Peut être un gaz ("gaz vecteur/porteur") ou un liquide ("éluant").

Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP ou HPLC)

La HPLC est une technique de chromatographie liquide performante caractérisée par l'utilisation d'une phase stationnaire à granulométrie fine nécessitant de hautes pressions et permettant des temps de rétention courts. * Processus : * Solubilisation des solutés dans un solvant. * Introduction du mélange (soluté + solvant) dans la phase mobile liquide. * Injection sous haute pression dans le système. * Les solutés se répartissent entre la phase mobile et la phase stationnaire selon leurs affinités. * Sortie séquentielle des différents solutés de la colonne. * Détection des solutés en sortie de colonne, générant un pic pour chaque soluté. * L'ensemble des pics enregistrés constitue un chromatogramme. * Notions importantes en HPLC : * Temps de rétention () : Temps passé par un soluté dans la phase stationnaire. C'est un paramètre caractéristique d'un composé dans des conditions données. * Efficacité de la séparation : Liée à la largeur du pic (un pic étroit signifie une meilleure efficacité). * Qualité de la séparation : Mesurée par la sélectivité (capacité à séparer deux solutés) et la résolution (degré de séparation entre deux pics). * Polarité : * Concept clé qui implique qu'une échelle de polarité existe entre les molécules. * La PS et la PM doivent avoir des polarités différentes pour que la séparation ait lieu. * Si la PM est polaire, les solutés polaires sont peu retenus par une PS apolaire et restent dans la PM (cas de la phase inverse). Inversement, si la PM est apolaire, les solutés apolaires sont peu retenus par une PS polaire (cas de la phase normale). * Polarité de phase : * Normale : PS polaire (ex: silice) + PM peu polaire. Les composés les moins polaires élueront en premier. * Inverse : PS apolaire (ex: silice + C18) + PM polaire. Les composés les plus polaires élueront en premier. * Élution : * Mode isocratique : La composition de la phase mobile reste constante pendant toute la séparation. * Gradient d'élution : La composition de la phase mobile change progressivement pendant la séparation pour améliorer la séparation des composés ayant des polarités très différentes.

Conclusion

Les méthodes analytiques en biochimie médicale sont vastes et diversifiées, allant des techniques électrochimiques (potentiométrie) aux approches optiques (spectrophotométrie d'absorbance et de réflectance), en passant par les immuno-essais basés sur la spécificité antigène-anticorps, et les méthodes de séparation telles que l'électrophorèse et la chromatographie. Chacune de ces techniques offre des avantages uniques et est adaptée à la détection et la quantification de différents types de biomolécules. La compréhension approfondie de leurs principes, applications, avantages et limitations est fondamentale pour une interprétation correcte des résultats cliniques et pour le développement de nouveaux outils diagnostiques. Le défi majeur reste la minimisation des interférences et l'amélioration de la standardisation pour garantir la fiabilité et la comparabilité des analyses à travers les laboratoires.