La chromatographie 

Ce document détaille les principes et applications de la chromatographie, notamment la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) et la chromatographie en phase gazeuse (CPG), en se concentrant sur les méthodes de séparation, de détection et de quantification.

Élutivité et Séparation

L'élutivité est la capacité d'une phase mobile à faire avancer un analyte à travers la phase stationnaire. Elle est cruciale pour la séparation chromatographique. Le choix de l'élutivité dépend de la nature de l'analyte ou des analytes à séparer.

Élutivité en fonction de l'Analyte

• Si un seul analyte est présent, on choisit une élutivité moyenne pour assurer sa bonne séparation [Source 1].

Élutivité en Chromatographie en Phase Inverse

La chromatographie en phase inverse utilise une phase stationnaire hydrophobe et une phase mobile hydrophile. L'élutivité est influencée par la polarité des liquides :

• Liquide hydrophile (peu élutif) : comme l'eau, favorise l'accrochage de l'analyte hydrophobe à la phase stationnaire [Source 2, 9].

• Liquide hydrophobe (fort élutif) : comme l'acétonitrile (ACN) ou le méthanol (MeOH), interagit avec la phase stationnaire et l'analyte, favorisant le décrochage de l'analyte [Source 2, 7, 9].

Élutivité en Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)

En CPG, la phase mobile est un gaz et la phase stationnaire est généralement solide ou un liquide immobilisé sur un support solide. L'élutivité est principalement régulée par la température :

• L'augmentation de la température favorise l'évaporation des analytes, augmentant ainsi l'élutivité [Source 2, 22].

Mode d'Élution

Isocratie

L'isocratie consiste à utiliser une composition constante de la phase mobile tout au long de la séparation.

• Adaptée si les analytes sont peu nombreux et possèdent des propriétés similaires [Source 2].

• Insuffisante si les analytes sont nombreux et/ou ont des propriétés très différentes [Source 2].

Gradient d'Élution

Le gradient d'élution implique une variation progressive des conditions de la phase mobile pour augmenter l'élutivité au fil du temps. Cela permet de séparer des analytes aux propriétés diverses [Source 2].

• Gradient de Température (CPG) : augmentation progressive de la température du four pour éluer séquentiellement les molécules [Source 2]. Exemple: séparation des acides gras où les molécules sont "décrochées" lorsque leur température d'ébullition est atteinte [Source 2].

• Gradient d'Hydrophobie (HPLC) : variation de la composition de la phase mobile pour la rendre progressivement plus hydrophobe. Cela commence par un solvant très hydrophile (ex: 100% eau) et évolue vers un solvant plus hydrophobe (ex: 100% acétonitrile) pour décrocher les analytes hydrophobes [Source 2, 7, 9]. Les molécules hydrophobes sont éluées lorsque la phase mobile interagit suffisamment avec elles et la phase stationnaire.

• Gradient de pH : utilisé pour la séparation de molécules ionisables comme les acides aminés sur des colonnes échangeuses d'ions [Source 2, 13].

  • Au départ, les molécules sont à un pH où elles sont chargées et immobiles.

  • En augmentant progressivement le pH (pour les colonnes échangeuses d'anions) ou en le diminuant (pour les colonnes échangeuses de cations), les molécules atteignent leur pH isoélectrique (où leur charge nette est nulle) ou une charge opposée, ce qui les rend mobiles et les fait éluer [Source 2, 13].

  • Exemple : les acides aminés sont séparés quand le pH de la phase mobile atteint leur pH isoélectrique — pH_iso — où la charge résultante est nulle, favorisant leur décrochage de la phase stationnaire [Source 2, 13].

Principes de Séparation Chromatographique

Plusieurs mécanismes dictent la séparation des analytes :

• Adsorption : les molécules adhèrent à une phase stationnaire solide [Source 4, 22].

• Partage : les molécules se dissolvent dans un film liquide constituant la phase stationnaire [Source 4, 22, 25].

• Échange ionique : séparation basée sur l'affinité des ions avec des charges fixes de la phase stationnaire. Les molécules chargées positivement sont retenues par des charges négatives fixes et éluées en modifiant le pH ou la force ionique de la phase mobile [Source 4, 13, 14].

• Affinité : séparation due à une interaction spécifique entre l'analyte et la phase stationnaire (ex: substrat-enzyme) [Source 4].

• Exclusion stérique : séparation basée sur la taille des molécules. Les petites molécules pénètrent dans les pores de la phase stationnaire et ont un temps de rétention plus long, tandis que les grosses molécules sont éluées plus rapidement car elles contournent les pores [Source 4, 11].

  • Inconvénients: le choix du solvant a peu d'influence sur l'élutivité et le gradient est impossible dans cette technique [Source 11].

  • Exemple : l'amylopectine (plus grosse) est éluée avant l'amylose lors de l'analyse de l'amidon du riz [Source 12].

• Volatilité (CPG) : les molécules les plus volatiles avancent le plus vite. Une dérivatisation est parfois nécessaire pour rendre les analytes non volatils analysables [Source 22, 33].

Préparation de l'Échantillon et de la Phase Mobile (HPLC)

• Les éluants doivent être ultra-purs (grade HPLC, grade gradient, eau mQ) pour éviter toute intermédiaire dans la détection [Source 4].

• Les solvants sont filtrés pour éliminer les particules qui pourraient obstruer la colonne et dégazés pour éviter la formation de bulles à la sortie de la colonne causée par la dépression [Source 4, 5].

• Un mélangeur programmable est utilisé pour générer les gradients de composition (ex: pH, hydrophobicité) de la phase mobile [Source 4, 5].

• Des pompes débimétriques assurent un débit constant de la phase mobile, même à hautes pressions [Source 4, 5].

• Un injecteur à vanne avec boucle d'injection permet d'introduire précisément l'échantillon dans le système sous haute pression [Source 4, 6]. La boucle d'injection garantit un volume constant à chaque injection [Source 6].

Composition de la Phase Stationnaire (HPLC)

En HPLC en phase inverse, les phases stationnaires sont souvent composées de chaînes alkyles greffées sur de la silice, rendant la surface hydrophobe (ex: ODS, C18, C8) [Source 7]. La phase stationnaire hydrophobe interagit fortement avec les analytes hydrophobes en milieu de phase mobile hydrophile [Source 7, 9].

Détecteurs en Chromatographie

Un détecteur doit être rapide, sensible (capable de détecter de faibles quantités), et reproductible [Source 15, 27].

Types de Détecteurs

1. Absorption UV-Visible :

   • Mesure l'absorption de la lumière par les analytes à certaines longueurs d'onde.

   • Peut utiliser une seule longueur d'onde, deux longueurs d'onde ou un balayage continu (DAD - Diode Array Detector) [Source 16].

   • Applicable aux molécules ayant des chromophores (doubles liaisons conjuguées, cycle benzénique, systèmes à résonance) [Source 16, 20]. Ex: liaisons peptidiques absorbent dans l'UV à 214 nm [Source 16].

   • Est moyennement spécifique (non universel) car plusieurs molécules peuvent absorber à la même longueur d'onde [Source 16, 20].

2. Fluorescence :

   • Détecte les molécules fluorescentes après excitation par une source lumineuse et émission de lumière à une longueur d'onde différente [Source 17, 18].

   • Offre une très haute spécificité et une grande sensibilité, permettant de détecter de très faibles quantités [Source 18].

   • N'est pas universel, car seules les molécules fluorescentes ou celles dérivatisées pour le devenir sont détectées [Source 18].

3. Indice de Réfraction (RI) :

   • Détecteur universel qui mesure le changement d'indice de réfraction de la phase mobile lorsque l'analyte est élué [Source 4, 12].

   • Utile pour des analytes qui n'absorbent pas dans l'UV (ex: sucres, certains polysaccharides) [Source 12, 20].

4. Électrochimiques :

   • Mesurent le courant généré par des réactions d'oxydo-réduction des analytes à la surface d'une électrode [Source 4].

5. Spectrométrie de Masse (SM ou MS) :

   • Considéré comme le meilleur détecteur car il fournit à la fois la quantification et l'identification des substances [Source 4, 6, 19].

   • Décompose les molécules en fragments ionisés, puis les sépare et les détecte en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) [Source 19, 31].

   • Génère un spectre de masse, une "empreinte digitale" unique pour chaque molécule, permettant l'identification par comparaison avec des bases de données [Source 19, 31, 32].

   • Est polyvalent et peut-être couplé à la HPLC (HPLC-MS) ou à la CPG (GC-MS) [Source 19, 27, 30, 32].

6. Détecteur à Conductibilité Thermique (TCD) en CPG (Catharomètre) :

   • Mesure la capacité du gaz à conduire la chaleur. La présence d'analytes dans le gaz vecteur modifie sa conductivité thermique, ce qui est détecté [Source 28].

   • Est peu sensible aux faibles quantités d'analytes mais est un détecteur général [Source 27, 28].

7. Détecteur à Ionisation de Flamme (FID ou DIC) en CPG :

   • Brûle les molécules organiques dans une flamme hydrogène/air, produisant des ions qui génèrent un courant électrique [Source 29].

   • Est très sensible aux molécules organiques [Source 29]. Le signal est proportionnel à la quantité de carbone présente [Source 29].

   • Est un détecteur général pour les composés organiques [Source 27, 29].

Applications de la Chromatographie

HPLC en phase inverse (RP-HPLC)

• RP-HPLC-UV: Utilisée pour les molécules organiques (médicaments, pesticides, vitamines, contaminants) ayant des chromophores UV [Source 20].

• RP-HPLC-MS: Outil de recherche exploratoire pour séparer, identifier et quantifier des molécules inconnues [Source 20].

• HPLC-UV préparative: Permet la purification de substances pures pour la recherche ou l'industrie pharmaceutique [Source 20]

• SEC-HPLC-RI: Analyse la répartition de taille des polysaccharides [Source 20].

Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG ou GC)

• Nécessite que les analytes soient volatils ou rendus volatils par dérivatisation [Source 22, 33].

• Gaz vecteur inerte (Hélium, Azote) est utilisé comme phase mobile [Source 21].

• Four thermostatisé permet le contrôle de la température (isotherme ou programmée en gradient) pour l'élution [Source 22].

• Colonnes capillaires longues (WCOT, SCOT, FSOT) avec un film liquide sur leurs parois sont la norme [Source 22, 25].

• L'injection peut être en mode split (une fraction de l'échantillon) ou splitless (l'intégralité) [Source 24]. Le mode split améliore la résolution des pics pour des échantillons concentrés [Source 24].

• Applications: dosage des molécules volatiles des aliments, parfums, phéromones, FAME (esters méthyliques d'acides gras), sucres dérivatisés, phtalates, antibiotiques dans le lait, pesticides [Source 33].

Identification et Quantification

Identification

• Temps de rétention (Tr) : La valeur de Tr est caractéristique d'un composé dans des conditions expérimentales données. L'identification se fait en comparant le Tr de l'analyte à celui d'un standard connu [Source 33, 34].

• Indices de Kovats/ELC (Equivalent Chain Length) : Pour les échantillons comportant un grand nombre d'analytes (ex: terpènes, acides gras), des indices basés sur des échelles de référence connues sont utilisés [Source 34, 35]. L'ELC est calculé en fonction du temps de rétention par rapport à des standards d'acides gras saturés de longueur de chaîne connue [Source 35].

Quantification

• Étalonnage direct :

  • L'aire sous le pic est proportionnelle à la quantité de l'analyte (), où est le facteur de réponse [Source 35, 36].

  • Nécessite une bonne répétabilité du volume injecté et de la réponse du détecteur, ce qui est souvent une limite [Source 36].

• Étalonnage interne :

  • Introduit une substance étalon interne (EI) dans tous les échantillons et standards. L'EI doit &

ecirc;tre proche des analytes, distinguable et absente de l'échantillon [Source 37].

• Permet de corriger les variations de volume d'injection et les fluctuations du détecteur en utilisant un rapport des aires/quantités [Source 37, 40].

• Formule de calcul : FRQ_AQ_{EI}$ sont les quantités de l'analyte et de l'étalon interne, respectivement [Source 40].

• Exemples d'EI : Norleucine pour les acides aminés, C13 ou C22 pour les acides gras, désoxyglucose pour les sucres [Source 38, 59].

• La quantification par étalonnage interne est la méthode préférée pour une précision et une exactitude accrues [Source 41].

Étude de Cas : Dosage de la Caféine par HPLC (Exemple pratique)

L'exemple décrit la procédure de dosage de la caféine dans du café soluble par HPLC en phase inverse avec détection UV-visible, en utilisant la théophylline comme étalon interne [Source 42, 43].

1. Préparation des solutions standards : La théophylline (EI) et la caféine sont préparées à des concentrations spécifiques à partir de pesées et dilutions précises [Source 45, 46].

2. Préparation des points de la droite d'étalonnage : Des mélanges de théophylline et de caféine (avec des proportions variables de caféine) sont préparés pour établir la courbe d'étalonnage [Source 47, 48].

3. Préparation des échantillons à analyser : Le café soluble est préparé et dilué, puis mélangé à la solution de théophylline (EI) [Source 47, 48].

4. Analyse HPLC : Les solutions standards et les échantillons sont injectés dans l'HPLC. Les aires des pics de caféine et de théophylline sont mesurées à 276 nm [Source 43, 48].

5. Établissement de la droite d'étalonnage : Le rapport est tracé en fonction du rapport pour les solutions standards. Cette droite permet de déterminer le facteur de réponse global [Source 50, 53].

6. Calcul de la quantité de caféine dans l'échantillon : À partir de la droite d'étalonnage, la masse de caféine dans les échantillons est déduite en utilisant le rapport des aires des pics de caféine et de théophylline [Source 51].

7. Calcul de la teneur finale : La teneur en caféine est exprimée en mg/100g de café soluble, en tenant compte des dilutions et des pesées initiales [Source 52, 54].

Analyse des Acides Aminés

L'analyse des acides aminés (aa) peut se faire par plusieurs méthodes :

• Méthode de Stein & Moore : Utilise un appareil spécifique aux aa, avec une HPLC échangeuse d'ions et une détection visible après dérivatisation à la ninhydrine (coloration mauve des amines primaires) [Source 20, 55, 56].

• HPLC fluorimétrie : Utilise un appareil universel, avec HPLC en phase inverse et détection fluorimétrique après dérivatisation des aa avant l'analyse [Source 55].

• Dosage de l'hydroxyproline : Méthode spécifique pour un seul aa (Hydroxyproline), sans séparation chromatographique [Source 55].

Quelle que soit la méthode, les étapes incluent généralement une hydrolyse des protéines en aa, une séparation chromatographique et une détection (souvent après dérivatisation pour rendre les aa visibles) [Source 55].

Conclusion

La chromatographie, qu'elle soit en phase liquide ou gazeuse, est une technique analytique polyvalente indispensable. Le choix de la méthode (isocratie vs gradient), de la phase stationnaire, du détecteur et de la méthode de quantification est crucial pour une séparation, identification et quantification précises des analytes dans des matrices complexes.