Introduction à l'Histologie et ses Méthodes

Définitions de l'Histologie

L'histologie est la science qui étudie l'organisation des tissus à l'état physiologique normal, ainsi que la détection et la localisation in situ des constituants moléculaires de l'organisme.

Langage Médical Courant

• Le terme "histologie" est souvent utilisé comme synonyme de "microscopie" ou "examen microscopique", ce qui est un raccourci réducteur.
• L'histologie s'est rapidement distinguée de l'anatomie microscopique purement descriptive et morphologique.
• Le développement de l'histophysiologie a permis de comprendre le fonctionnement des tissus.
• L'introduction de la microscopie électronique dans les années 1960 a révolutionné la discipline en décrivant les ultrastructures, menant à une réécriture complète de la cytologie et de l'histologie.
• La cytologie étudie les cellules à l'état normal physiologique.

Spécificité de l'Histologie

• L'histologie se distingue des autres sciences biologiques par l'identification et la localisation in situ des molécules.
• Elle englobe la cytologie, l'histologie, l'embryologie et la cytogénétique moléculaires, indispensables à la compréhension des mécanismes biologiques normaux et pathologiques.
• Ceci est rendu possible par l'utilisation conjointe de:
  • Moyens d'observation microscopique modernes (photonique, à fluorescence, électronique, confocal).
  • Techniques modernes de détection in situ des molécules (histochimie, histoenzymologie, immunocytochimie, hybridation moléculaire in situ, PCR in situ).

Objectif de l'Histologie

• Visualiser les molécules (gènes, ARN-messagers, protéines) dans les tissus, les cellules, leurs organites ou la matrice extracellulaire.
• Déterminer précisément l'emplacement et la configuration des différentes molécules.
• La notion fondamentale d'in situ distingue l'histologie de la biochimie:
  • La biochimie étudie les molécules, leur structure, propriétés et forme dans l'espace à partir de broyats d'organes ou de tissus, sans tenir compte de leur localisation précise.
  • L'histologie vise à détecter, identifier et localiser les molécules constitutives de l'organisme vivant.
  • L'histologie actuelle est l'histologie et cytologie moléculaires.

Concept de Tissu

Un tissu est un ensemble coopératif de cellules différenciées qui forment une association territoriale, fonctionnelle et biologique.

Différents Niveaux d'Organisation Structurale de l'Organisme

L'organisme est organisé en plusieurs niveaux, du plus complexe au plus élémentaire:

1. Systèmes et appareils
2. Organes
3. Tissus
4. Cellules
5. Organites
6. Macromolécules
7. Petites molécules

Ces niveaux sont couverts par des disciplines distinctes, dont les champs se recouvrent en partie:

• Anatomie: Description macroscopique des systèmes (nerveux, cardiovasculaire), appareils (digestif, respiratoire, urinaire) et organes (cœur, rate, foie, estomac).
• Microscopie optique: Description microscopique des tissus (premier niveau d'organisation supra-cellulaire) et des cellules (unité élémentaire de vie).
• Microscopie électronique: Étude des organites.
• Biochimie, Biologie moléculaire, Cytologie et histologie moléculaires: Étude des molécules.

Différents Types Tissulaires

Il existe 4 grandes familles de tissus:

• Épithéliums
• Tissus conjonctifs
• Tissus musculaires
• Tissu nerveux

À ces familles s'ajoutent les populations cellulaires libres (systèmes cellulaires dispersés ou cellules migratrices), distribuées dans tout l'organisme (sang, lymphe, organes immunitaires, tissu conjonctif, épithéliums). Les cellules de la lignée germinale ont une place à part.

La plupart des organes contiennent plusieurs variétés de tissus. Par exemple, la paroi de l'estomac comprend:

• Épithélium de revêtement
• Épithéliums glandulaires
• Tissu conjonctif
• Tissu musculaire lisse
• Tissu nerveux périphérique
• De nombreuses variétés de cellules libres

Les cellules sont reconnaissables par leur noyau et le cytoplasme qui l'entoure, avec d'éventuels organites. En microscopie optique, le noyau est généralement violet sur la plupart des colorations.

2 Types d'Épithéliums

• Épithélium de revêtement des surfaces internes: Borde les cavités internes de l'organisme, soit en continuité avec l'extérieur (voies respiratoires, tube digestif, voies urinaires), soit des cavités closes (cavités vasculaires).
• Épithélium de revêtement des surfaces externes: Revêt la surface externe du corps (épiderme de la peau).
• Glandes ou épithéliums glandulaires: Ont une fonction de sécrétion. Exemples:
  • Glandes sudorales (sécrétion de sueur).
  • Glandes sébacées (sécrétion de sébum).

2 Types de Tissus de Soutien Conjonctif

• Tissu conjonctif commun (lâche):
  • Le plus diffus dans l'organisme, sauf dans le système nerveux central.
  • Peu visible macroscopiquement, composé d'eau, de macromolécules (glycosaminoglycanes, protéoglycanes), de fibres de collagène et de fibres élastiques.
  • Peut être associé à de la graisse (tissu adipeux) pour un rôle de soutien et de protection renforcé (ex: pulpe des doigts, graisse rétro-orbitaire).
  • Fonctions: soutien, nutrition (grâce aux vaisseaux sanguins), communication des cellules immunitaires.
• Tissus conjonctifs spécialisés:
  • Tissu conjonctif dur: cartilage et os (ex: nez).

2 Types de Tissus Musculaires

• Tissu musculaire strié squelettique: Responsable des mouvements volontaires.
• Tissu musculaire lisse: Responsable des mouvements autonomes (ex: contraction des vaisseaux, propulsion du bol alimentaire).

3 Types de Tissus Nerveux

Le système nerveux est divisé en:

• Système nerveux central (SNC): Localisé dans l'encéphale (cerveau, cervelet, tronc cérébral) et la moelle épinière.
• Système nerveux périphérique (SNP): Responsable des sensations (douleur, chaleur, pression). Présent dans tous les organes.
• Système nerveux périphérique autonome ou végétatif: Fonctionnement autonome des organes internes (battement du cœur, circulation sanguine, digestion), sans action volontaire.

Méthodes de l'Histologie Morphologique

Les méthodes histologiques visent à observer, interpréter et donner un sens aux images des structures biologiques.

Objectifs

• Voir: Observer les structures.
• Interpréter: Comprendre ce qui est vu.
• Préparation des échantillons: Rendre visibles les structures ou phénomènes à étudier.
• Observation microscopique: Observer ces structures sous forme d'images.
• Interprétation: Donner un sens à ces images.

Préparation des Échantillons

La préparation implique la mise en œuvre de techniques pour rendre visible ce que l'on veut observer. Ces techniques sont appliquées à des échantillons de cellules, tissus ou fragments d'organes.

Techniques "Standard"

Les procédures techniques pour l'observation en microscopie optique (MO) ou électronique (ME) suivent des principes analogues et des étapes successives:

1. Prélèvement
2. Fixation
3. Déshydratation
4. Inclusion
5. Coupe
6. (Réhydratation)
7. Coloration
8. (Déshydratation)
9. Montage

Microscopie Optique en Histologie (Tissus)

• Fixation:
  • But: Conservation des structures et durcissement des pièces.
  • Immédiatement après le prélèvement, par immersion dans un liquide fixateur (ex: formol).
  • Durée variable selon le volume du prélèvement.
• Inclusion:
  • But: Permettre la manipulation du tissu et la réalisation de coupes fines et régulières.
  • Milieu d'inclusion le plus utilisé: paraffine.
  • Nécessite une déshydratation préalable (bains d'alcool, xylène) car la paraffine est hydrophobe.
  • Infiltration de la pièce par la paraffine fondue (56°C), puis refroidissement pour obtenir un bloc dur.
  • D'autres milieux d'inclusion peuvent être utilisés dans des cas particuliers.
• Coupes:
  • Réalisation de coupes fines (2 à 5 µm d'épaisseur) du bloc de paraffine à l'aide d'un microtome.
  • Les coupes sont recueillies et collées sur des lames de verre.
• Colorations:
  • Réalisées sur les lames.
  • Nécessitent un déparaffinage (chaleur, xylène) et une réhydratation (bains d'alcool, eau distillée).
  • But: Accentuer les contrastes pour mieux distinguer les éléments.
  • Colorations fréquemment utilisées:
    • Hématéine-Éosine (H.E.):
      • Hématéine: Colore en violet les structures acides (noyaux riches en acides nucléiques).
      • Éosine: Colore en rose les structures basiques (la plupart des cytoplasmes).
    • Colorations trichromiques usuelles:
      • Hématéine-Éosine-Safran (H.E.S.): Ajout de safran qui colore en jaune les fibres de collagène.
      • Trichrome de Masson: Association d'un colorant nucléaire (hématoxyline), d'un colorant cytoplasmique et d'un bleu ou vert pour les fibres de collagène.
    • Orcéine: Colore en noir les fibres élastiques.
• Montage:
  • Déshydratation préalable (bains d'alcool, xylène).
  • Montage des coupes colorées entre lame et lamelle avec une résine synthétique.
  • La "préparation microscopique" est alors prête à être observée.

Étude Microscopique des Tissus Congelés

• Congélation des tissus:
  • Utilisée pour l'histologie moléculaire et l'analyse du tissu musculaire squelettique.
  • Prélèvement congelé rapidement à très basse température (-80°C) avec un cryoprotecteur (isopentane).
  • L'isopentane se substitue à l'eau pour éviter la cristallisation et l'altération morphologique.
  • Le prélèvement doit être maintenu à une température inférieure à -18°C (conservation à -80°C, transport en carboglace).
• Coupes du bloc congelé:
  • Réalisées avec un cryostat (5 à 50 µm d'épaisseur) à -20°C.
  • Les coupes sont recueillies sur des lames de verre et séchées à l'air (étape de fixation).
• Colorations:
  • Toutes les colorations utilisées pour les coupes en paraffine sont applicables.
  • L'intérêt principal est l'application des techniques d'histologie moléculaire.

Microscopie Optique en Cytologie (Cellules)

• Principe: Technique cytologique "standard" impliquant un étalement des cellules plutôt qu'une coupe, adaptée aux matériaux fragiles.
• Étapes: Étirement immédiat sur lame, fixation, coloration, montage.
• Étirement sur lame:
  • Frottis (avec ou sans centrifugation préalable).
  • Appositions (application directe du tissu sur la lame).
  • "Pastilles" de cytocentrifugation (projection des cellules sur la lame via une cytocentrifugeuse).
• Fixation:
  • Simple séchage à l'air.
  • Fixateurs à base d'alcool éthylique ou méthylique.
• Colorations:
  • Basées sur les propriétés de basophilie et d'éosinophilie.
  • Les plus utilisées: Papanicolaou, May Grunwald Giemsa (MGG).
  • Colorent les éléments basophiles en violet et les éléments acidophiles en rose orangé.
  • Permettent de mettre en évidence le caractère métachromatique de certaines structures (capacité à modifier la couleur du colorant).
• Montage: Identique à celui des préparations histologiques.

Microscopie Électronique

• Fixation:
  • Habituellement avec du glutaraldéhyde tamponné.
  • Suivie d'une post-fixation par le tétroxyde d'Osmium (OsO4).
• Inclusion:
  • Déshydratation préalable dans les alcools et l'oxyde de propylène.
  • Inclusion dans une résine synthétique durcie par polymérisation (ex: Epon, Araldite).
• Coupes:
  • Coupes ultrafines (environ 80 nm d'épaisseur) des blocs à l'aide d'un ultramicrotome.
  • Coupes recueillies sur des grilles de cuivre.
• Coloration (Contraste):
  • Habituellement avec de l'acétate d'uranyle (contraste les nucléoprotéines: noyau, nucléole, ribosomes).
  • Des sels de plomb (citrate de plomb) contrastent les membranes.

Production et Conservation des Images

• Production des images par des moyens optiques:
  • Loupes
  • Microscope optique ou photonique standard
  • Microscope à fluorescence (rayons ultra-violets - UV)
  • Microscopes électroniques (à transmission ou à balayage)
  • Microscope confocal: Particulièrement intéressant en recherche. Analyse par laser de nombreux niveaux superposés, assistée par ordinateur. Produit des images digitalisées, permet de détecter des fluorochromes de couleurs différentes et d'effectuer des reconstructions 3D.
• Conservation des images:
  • Photographie (procédé habituel pour la microscopie électronique)
  • Cinéma
  • Vidéo
  • Digitalisation/Numérisation (stockage, archivage, transmission à distance)

Interprétation des Images: Se Méfier des Artéfacts

Les artéfacts sont des images artificielles créées par la technique ou des déformations dues aux imperfections des moyens d'observation. Il existe un risque fréquent de mauvaise préservation des tissus.

Exemples d'artéfacts dans une préparation histologique de routine (fixée au formol, incluse en paraffine, colorée à l'hématéine-éosine):

• Artéfacts de prélèvement: Pinces, ciseaux, coagulation, gelures.
• Artéfacts de décongélation: Rupture de la chaîne du froid.
• Artéfacts de fixation: Dessèchement, retard de fixation, fixateur trop ou trop peu concentré, pigment formolique.
• Artéfacts d'inclusion: Vides artificiels dus à la rétraction des cellules ou des tissus.
• Artéfacts de coupe: Stries de rasoir, coupes trop épaisses ou trop minces.
• Artéfacts de collage: Décollements, plis et replis de la coupe.
• Artéfacts de montage: Bulles d'air entre la lame et la lamelle.
• Artéfacts de coloration: Empâtements, dépôts, taches de colorant.

Points Clés

• L'histologie est l'étude de l'organisation tissulaire et la localisation moléculaire in situ.
• Le corps humain est organisé en systèmes, organes, tissus, cellules, organites et molécules.
• Les 4 tissus fondamentaux sont les épithéliums, les tissus conjonctifs, les tissus musculaires et le tissu nerveux.
• La préparation des échantillons pour l'histologie implique la fixation, la déshydratation, l'inclusion, la coupe et la coloration.
• La microscopie optique utilise des colorations comme l'H.E. ou l'H.E.S. pour visualiser les structures.
• La microscopie électronique permet d'observer les ultrastructures après fixation au glutaraldéhyde et inclusion en résine.
• L'interprétation des images doit tenir compte des artéfacts, qui sont des altérations dues aux techniques de préparation.