Méthodes d'étude des chromosomes en cytogénétique

Cytogénétique : Méthodes d'étude des Chromosomes

La cytogénétique est l'étude des structures et du fonctionnement des chromosomes, à la fois normaux et pathologiques. Elle permet de détecter les anomalies chromosomiques constitutionnelles ou acquises, qu'elles soient de nombre ou de structure.

Objectifs Clés

• Définir le caryotype et ses étapes.

• Décrire les principes de la FISH (Hybridation In Situ en Fluorescence).

Introduction à la Cytogénétique

• Cytogénétique médicale : Détection des anomalies chromosomiques.

• Types d'anomalies :

  • De nombre (ex: Trisomie 21).

  • De structure.

• Cytogénétique classique :

  • Caryotype standard (1959 : première anomalie chromosomique, Trisomie 21).

• Cytogénétique moléculaire :

  • Hybridation in situ.

  • CGH (Hybridation Génomique Comparative).

Structure des Chromosomes

Les chromosomes sont des structures essentielles pour le maintien de l'information génétique. Leur compaction et décompaction sont cruciales pour la régulation de l'expression des gènes.

De l'ADN au Chromosome

• L'ADN eucaryote est compacté :

  • Autour de protéines appelées Histones (H1, H2A, H2B, H3, H4) – les protéines nucléaires les plus abondantes.

• L'unité de base de la compaction est le nucléosome :

  • Composé de (2xH2A + 2xH2B + 2xH3 + 2xH4) + H1.

• Six nucléosomes s'enroulent pour former une fibre de chromatine de 30 nm.

États de la Chromatine

• Euchromatine :

  • Chromatine peu condensée.

  • Information génétique facilement accessible.

• Hétérochromatine :

  • Chromatine très condensée.

  • Information génétique difficilement accessible.

• Pendant la mitose :

  • La chromatine est ultra condensée sous forme de chromosomes.

  • L'accès à l'information génétique est impossible.

Structure du Chromosome Individuel

• Longue molécule d'ADN associée à des protéines histones.

• Visibles pendant la métaphase de la mitose.

• Apparaissent sous forme de 2 chromatides sœurs.

• Chaque chromatide sœur est constituée de :

  • Un bras court (p).

  • Un bras long (q).

  • Reliés par un centromère.

• Les extrémités sont les télomères :

  • Séquences d'ADN allongées par la télomérase.

  • Évitent le raccourcissement des chromosomes.

Techniques de Cytogénétique

Cytogénétique Conventionnelle : Caryotype Standard

• Définition :

  • Représentation graphique classée de l'ensemble des chromosomes d'un individu.

  • Chez l'homme : 46 chromosomes ().

• Principe : Les chromosomes sont visibles uniquement en métaphase.

  • Nécessite des cellules en division (spontanée ou cultivée).

• Étapes de la technique classique :

  1. Culture cellulaire : Durée variable (Sang : 72-96h, Amniocytes : 10 jours, Fibroblastes : 3 semaines).

  2. Blocage en métaphase : Utilisation de colchicine.

  3. Choc hypotonique : Fragilisation des membranes, dispersion des chromosomes.

  4. Fixation : Mélange Méthanol/Acide Acétique.

  5. Étalement sur lames.

  6. Coloration GIEMSA : Aspect rose violacé. La reconnaissance par taille et forme des

chromosomes est difficile sans marquage spécifique.

• Techniques de marquage (pour reconnaissance) :

  • Donnent une coloration inhomogène avec succession de bandes claires et sombres.

  • Bande G : Dénaturation enzymatique (trypsine) + Giemsa.

  • Bande R : Dénaturation thermique + Giemsa.

  • Bande C : Baryum + Giemsa (hétérochromatine constitutive régions centromériques).

  • Bandes Q : Quinacrine.

  • Bandes T : Télomériques.

• Classification des chromosomes :

  • Taille décroissante (groupes A à G).

  • Indice centromérique () :

    • Métacentrique : (Chr. 1, 3, 11, 16, 18, 19, 20).

    • Submétacentrique : (Chr. 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 17).

    • Acrocentrique : bras court quasi inexistant (Chr. 13, 14, 15, 21, 22).

  • Données des bandes : Nombre et intensité.

    • La résolution d'un caryotype standard est de 300 à 550 bandes par lot haploïde (détecte des remaniements de 10 Mb).

    • Haute résolution : jusqu'à 1000 bandes (résolution augmentée par déspiralisation).

• Nomenclature (ISCN 2016) :

  • Format : Nombre de chromosomes , Formule sexuelle. Ex: 46,XX ; 46,XY.

  • Localisation précise : Numéro du chromosome, bras (p ou q), région, bande, sous-bande. Ex: 6p21.

• Indications :

  • Nouveau-né et enfant : Ambiguïtés sexuelles, polymalformations, retard mental, dysmorphie, retard de croissance, leucémie.

  • Adulte : Aménorrhée, anomalies du spermogramme, hypogonadisme, avortements à répétition, leucémie, bilan de PMA.

Cytogénétique Moléculaire

Permet une analyse plus fine des chromosomes, détectant les microremaniements.

Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH)

• Description : Caractérise les microremaniements chromosomiques < 3 Mb.

• Principe : Utilisation d'une sonde marquée (séquence d'ADN complémentaire) pour repérer des séquences spécifiques d'ADN.

  • Dénaturation : Séparation des deux brins d'ADN.

  • Renaturation : Réassociation spécifique avec la séquence complémentaire.

• Réalisable sur :

  • Chromosomes métaphasiques : Détection de réarrangements structuraux.

  • Noyaux interphasiques : Détection d'anomalies de nombre (ex: Trisomie 21).

• Étapes :

  1. Dénaturation de l'ADN cible.

  2. Hybridation avec la sonde fluorescente.

  3. Lavage et Révélation.

  4. Analyse sous microscope à épifluorescence.

• Sondes : Séquences d'acides nucléiques marquées par des fluorochromes.

  • Séquences d'ADN répété (centromères, télomères) ou séquences uniques (locus spécifiques, "peintures" chromosomiques).

• Nomenclature (ISCN 2009) :

  • Format : Formule chromosomique .ish NOM DU CHROMOSOME ET DE LA RÉGION ANALYSÉE (SONDE UTILISÉE ET SON STATUT).

  • Ex : 46, XY.ish 22q11 (D22S75x2).

Hybridation Génomique Comparative (CGH)

• Permet une analyse encore plus fine.

• Détection de

microremaniements.

• CGH array : résolution d'environ 1 kb.

• Puces à ADN : Permettent d'analyser le niveau d'expression des gènes sur un support solide.