Méthodes de recherche pneumologique

Méthodologie de la Recherche Médicale et Chirurgicale : Aide-Mémoire

I. Introduction aux Méthodologies de Recherche

1. Éléments Fondamentaux

• La recherche médicale et chirurgicale est une UE de Master (UE 7.309).

• Objectif : Acquérir les connaissances de base des méthodologies de recherche.

• Apprentissage en ligne (E-learning) : Diverses méthodes (informel, actif, hybride, collaboratif, auto-dirigé, micro, mobile, multimodal, personnalisé, basé sur le travail/projet, tout au long de la vie).

• La filière Médicale Francophone Nancy-Wuhan existe depuis 20 ans, avec un DIU depuis 2008.

2. Thèmes Abordés

• Éléments de base : Informations scientifiques et techniques (bases de données, publications), méthodes en biologie moléculaire (ADN, ARN, gènes, protéines), biologie cellulaire (imagerie, modèles animaux).

• Applications : Hémato-oncologie, nutrition, pathologies du vieillissement, pathologies inflammatoires, chirurgie robotique, greffes, biothérapies (cellulaire, génique, moléculaire).

3. Examen

• 3 questions ouvertes et courtes (15 points).

• Active Learning (5 points) : Curation d'un sujet via Scoop.it (50 posts maximum, résumés/commentaires, mots-clés).

4. Où et Qui Fait de la Recherche

• Lieux : Universités (EPST, EA), CHU (CIC, Thèques, Cancéropôles), Industrie (Labos Pharma, Start-ups, Biotech, Imagerie).

• Soutien : États, organismes publics (Ministères, Régions, Europe), organismes privés (Industrie, Associations).

5. Pratiques en Recherche

• Expérimentations, manipulations en laboratoire, travail avec animaux et patients, recueil de données, statistiques, lecture et écriture scientifique.

6. Évolutions et Défis

• Infobésité : Surplus d'informations pouvant nuire à la connaissance. Nécessité de devenir autodidacte face à l'évolution rapide des outils.

• MIL (Media and Information Literacy) Week : Vise à améliorer la capacité à communiquer sous toutes ses formes (numérique, digital, santé).

7. Gestion de l'Information

• Accéder, sélectionner, stocker, utiliser l'information (bases de données, centres de documentation).

• Masse d'information gigantesque et en croissance exponentielle (ex: 7 articles/minute).

• L'anglais est la langue internationale de la science.

II. Information Scientifique et Technique (IST)

1. Définition de l'IST

• Matière première et produit fini du scientifique.

• Produit à haute valeur ajoutée et stratégique.

• Budget mondial : 27 milliards USD (2020).

2. Comparaisons (métaphores)

• Prolifération "tumorale", inégalités géographiques, "mémoire" et "apoptose".

• Le curateur valorise, prend soin de l'information.

3. Historique de l'IST

• Phénomène récent (1,5 siècle).

• De la monographie à la publication à plusieurs milliers d'auteurs.

• Début : Philosophical Transactions (Anglais) et Journal des Sçavans (Français) en 1665.

• XVIIIe siècle : L'Encyclopédie française.

• XIXe siècle : Influence allemande.

• XXe siècle : USA.

• XXIe siècle : Monde entier, en volume par la Chine.

4. Circulation de l'Information Scientifique

• Analogue au cycle de l'eau : réception, production, stockage (archives).

5. Classement de l'Information

• Sources primaires : Notebook de laboratoire (informatisé désormais).

• Sources secondaires : Bases de données bibliographiques, revues.

• Sources tertiaires : Médias scientifiques et non-scientifiques.

6. Documents Primaires

• Littérature en noir et blanc : Articles originaux, lettres, revues, livres, textbooks (ouvrages de référence américains).

• Littérature en couleur : Journaux et magazines (ex: Nature, Science - parfois plus axés sur l'audience que la rigueur).

• Littérature grise : Non publiée (thèses, brevets, rapports).

• Littérature multicolore : Catalogues commerciaux.

III. Les Articles Scientifiques

1. Fonctions d'une Revue Scientifique

• Dissémination de l'information.

• Contrôle qualité (peer reviewing - sous pression).

• Constitution d'archives "canoniques" (références brutes).

• Reconnaissance des auteurs.

• DOI (Digital Object Identifier) : Identifiant unique pour chaque article.

2. Anatomie d'un Article Scientifique

• Titre "self-explaining".

• Auteurs et adresses.

• Résumé structuré (mots-clés, abréviations).

• Introduction (rational).

• Matériel et méthodes (reproductibilité).

• Résultats (statistiques).

• Figures et tableaux (légendes explicatives).

• Discussion (mise en question, hypothèses).

• Références bibliographiques (format Vancouver).

• Remerciements (collaborations, financements).

3. Recherche d'Articles

• Mots-clés, langage naturel, systèmes d'indexation (ex: MeSH).

4. Lecture et Écriture d'un Article

• Lecture : Ne se lit pas dans l'ordre ! Le "Désordre de Lecture" :

  1. Remerciements (pour les financements - à relativiser).

  2. Fin de l'introduction/début discussion (message principal).

  3. Méthodes (actualité).

  4. Références (actualité et lien avec le sujet).

  5. Légendes des figures/tableaux (informations clés).

  6. Introduction et discussion (contexte et cohérence).

  7. Résultats (en dernier).

• Écriture : Prévoir du temps, travail d'équipe.

5. Production d'Information (Cycle de Vie d'un Article)

• Conception : Travail d'équipe majoritairement.

• Embryologie : Longue, nombreux échecs. Consigné dans Notebooks.

• Peer Review : Étape cruciale pour la qualité et les financements. Problème de saturation des Reviewers. Peut être anonyme, sources de conflits d'intérêts.

• Vie/Mort : Lieu de publication (influence), cité et utilisé. La "vie sociale" et "vie personnelle" d'un article.

6. Indicateurs d'Évaluation des Articles

• Fréquence de citation : Peu d'articles sont très cités.

• Facteur d'Impact (IF) : Rapport citations/publications sur 2 ans. Conçu par Eugène Garfield. Utile pour les bibliothécaires, mais biaisé pour évaluer les auteurs.

• Autres : SCI, H index.

• "Not everything that can be counted counts and not everything that counts can be counted!" - William Bruce Cameron.

7. Aspects Négatifs et Dérives

• Revues prédatrices : Manque de rigueur scientifique (pas de reviewing), publient contre paiement. Se sont multipliées (notamment avec la COVID-19).

• Mauvais comportements d'auteurs : Tricherie, plagiat, fraude, hyper-prolifiques (plus de 3 articles/semaine - impossible).

• Plateformes illégales : SCI-HUB (accès libre à des millions d'articles via contournement - illégal).

• Repositories : Mini-bases de données en libre accès (souvent obligatoires).

• Aspect financier : L'Open Access pose la question de la propriété et du financement des publications.

IV. Évolutions Numériques et Ressources

1. Opportunités de l'Électronique

• Indexation : Texte intégral, pas seulement mots-clés.

• Contenu actif : Images, simulations, vidéos, liens hypertextes.

• Séminaires vivants : Open peer comments.

• Open Access : Accès libre (Google Scholar, Thèses.fr).

• Réseaux sociaux : Linkedin, Academia.edu, Research Gate.

• Classement des données : Logiciels de bibliographie (ZOTERO).

• Bases de données : Crossref, Dimensions, Google Scholar, Scopus, Web of Science.

2. Supports et Accès à l'Information Secondaire ou Tertiaire

• Magazines d'actualités, journaux médicaux, supports audiovisuels, sites internet (Wikipédia).

• Abbonements, bibliothèques, photocopies.

3. Bases de Données (Médicales)

• PubMed (gratuit grâce à Al Gore), Medline, NLM (National Library Of Medicine).

• Importance de consulter plusieurs bases pour une information complète.

4. Ressources pour l'Apprentissage

• MOOCs (Massive Open Online Course) : Accès libre, mais peu achèvent.

• Podcasts, Webcasts : (Micro-Learning) NEJM, Nature, Science, UMVF.

• Sites spécialisés : Medscape, Cochrane (référentiels internationaux), McMaster.

• Outils de curation : Scoop.it, RSS, Pearltrees.

• Open Access : Google Scholar, Thèses.fr.

• La sérendipité ("découverte par hasard") est un aspect essentiel de la recherche (Ex: Pénicilline par Fleming).

5. Méthodes de Travail

• Recherche : Active Learning (cahier de laboratoire, electronic-lab-book).

• Université : Workplace based assessment (conférences, cas cliniques, rapports), Portfolio/E-portfolio (Logbook).

6. L'IA dans la Recherche

• Assistant numérique essentiel.

• Exemple : ChatGPT, Perplexity (donne les références).

• Importance de bien formuler les questions (prompt engineering).

V. Recherche Chirurgicale

1. Introduction à la Chirurgie Expérimentale

• Anciennement "faire des essais". Aujourd'hui plus large.

• Remplacement des cadavres par mannequins et impression 3D (courbe d'apprentissage reproductible).

• Utilisation d'animaux de plus en plus difficile (restrictions éthiques).

2. Spécificités de la Chirurgie

• Multiplicité de facteurs : variations individuelles (anatomiques, physiologiques), variations du chirurgien (habiletés), du matériel, du travail d'équipe.

• Ces spécificités génèrent de nombreux biais.

3. Expérimentation Animale : Règle des 3R et 3A

• Règle des 3R :

  • Remplacer : Si possible, par méthodes alternatives (tissus, cellules, modèles IA).

  • Réduire : Diminuer le nombre d'animaux utilisés (passer de +60 à 6-12).

  • Affiner : Améliorer le bien-être animal, minimiser la souffrance.

• Règle des 3A (du Professeur) :

  • Anesthésie : Anesthésier dès que possible.

  • Analgésie : Assurer le suivi et la prise en charge de la douleur.

  • (H)abilité chirurgicale : Maîtriser le geste, éviter l'acharnement.

• Historique : Animaux considérés comme égaux (XIIe siècle) à du "mobilier" (Révolution Industrielle). Lois de protection progressive (Loi Grammont 1850).

• Interventions : Non-chirurgicales (superficielles, sans anesthésie) vs chirurgicales (massive, anesthésie, suivi post-op).

• Reconnaissance des signes de douleur spécifiques aux espèces (rat, hamster, cochon, chien).

4. Exemple : Infarctus du Myocarde (IDM)

• Définition : Obstruction coronaire, nécrose des cardiomyocytes, fibrose, insuffisance cardiaque.

• Traitement : Pontage (contourner le village détruit), thérapie cellulaire (réintroduire des cellules).

• Cellules : Cellules souches (totipotentes, multipotentes) pour remplacer les cardiomyocytes. Rejet problématique.

• Expérimentation animale (rat) : Ligature coronaire pour induire un IDM. Grande variabilité des résultats.

• L'injection de cellules souches doit être faite dans une zone encore viable.

5. Difficultés de la Recherche Chirurgicale

• Financement : Très coûteux (matériel high-tech, animaux). Sources : bourses, appels à projets (STIC), PHRC, associations, labos. Peu de crédits publics directs.

• Valorisation scientifique : Publications chirurgicales souvent moins bien classées. Nécessité de sujets porteurs (COVID, cancer) ou collaborations.

• Temps disponible : Charge de travail élevée limite le temps pour la recherche.

• Unités de recherche : Moins nombreuses que médicales.

6. Biais en Chirurgie

• Biais de sélection : Très fréquent (ex: réparation hernie inguinale - endoscopie vs laparotomie, exclusion obèses).

  • Parades : Randomisation (difficile), stratification, comparaison avec littérature (attention aux changements contextuels).

  • Exemple : Étude sur adénocarcinomes nasaux (professeur lui-même, changement de technique).

• Biais préopératoires : Différences entre centres (protocoles, équipements, suivi), entre chirurgiens (techniques, habitudes).

  • Parades : Harmonisation, protocoles détaillés, stratifier par centre/chirurgien (souvent difficile).

• Biais de performance : Lié à la fatigue, communication, efficience de l'équipe (risque de complications augmente avec le temps).

• Biais concernant le suivi : Perte de vue (patients satisfaits ou insatisfaits ne reviennent pas).

  • Parades : Études prospectives, minimiser la lourdeur du suivi.

• Biais d'évaluation : Effet placebo, subjectivité (esthétique), égo du chirurgien.

  • Parades : Double aveugle (difficile), séparer effecteur/évaluateur, critères objectifs, vidéos, multiples évaluateurs.

• Biais liés aux courbes d'apprentissage : Les premières procédures sont biaisées. Ne pas les inclure ou les utiliser pour comparer par rapport à la technique classique.

7. Comparaison avec Traitements Médicaux

• Très difficile à comparer (ex: pontage coronarien vs traitement médical).

• Les options, patients, et résultats sont fondamentalement différents.

VI. Recherche en Foetopathologie

1. Définition et Objectifs

• Étude de la perte de l'embryon/fœtus/nouveau-né.

• Déterminer : physiopathologie (cause mort), risque de récurrence, lien phénotype/génotype.

• Mécanismes d'immunosuppression maternofoetale (syncytiotrophoblaste, placenta).

2. Examen Foetopathologique

• Circonstances : Spontanées (2/3) ou après IMG (1/3).

• Objectifs : Description des malformations, diagnostic, conseil génétique, contrôle qualité DPN.

• Examen d'un fœtus frais, rapidement, après histoire de grossesse détaillée.

• Examen radiologique obligatoire : datation osseuse, malformations, lésions squelettiques.

• Anatomopathologie macroscopique (externe/interne).

• Anatomopathologie microscopique (histogenèse : placentaire, pulmonaire, rénale).

  • Test Docimasie pour poumon (flottaison).

• Étiologie la plus importante des pertes : infection (bactérienne, virale).

• Effet toxique des médicaments (tout ou rien 1-8 sem SA).

3. Étude Biologique/Génétique

• Caryotype : Anomalies chromosomiques (aneuploïdies).

• ACPA (Analyse Chromosomique par Puce à ADN) : Détection variations quantitatives génome.

• OMIM/Exome/Génome : Étude des segments liés aux phénotypes délétères.

4. Cas Clinique : Syndrome Transfuseur-Transfusé (STT)

• Gémellité monochoriale bi-amniotique.

• J1 (transfusé) = MFIU, polyglobulique, cœur hypertrophique.

• J2 (transfuseur) = Anémie sévère, agénésie trachéale, fistule œsophagobronchique basse, atrésie duodénale (Syndrome de VATER/VACTERL).

• Outils bioinformatiques pour génotype/phénotype : OMIM, STRING, DGV, DECIPHER, UCSC.

VII. Recherche en Pharmacologie

1. Discipline Large et Exemples

• STP (Suivi Thérapeutique Pharmacologique) : Efficacité/toxicité, optimisation des traitements.

• Pharmacocinétique de population : Devenir du médicament en fonction de facteurs individuels (modèles, IA).

• Pharmacogénétique : Gènes modulant la réponse au médicament (génotypes influençant PK/PD).

• Pharmacovigilance : Surveillance post-commercialisation, déclaration effets indésirables, réajustement Bénéfice/Risque.

• Pharmacoépidémiologie : Essais cliniques, amélioration prise en charge.

• Addictovigilance : Mésusage médicaments/drogues, conséquences cliniques.

2. Types de Recherche en Pharmacologie

• Fondamentale : Étude des mécanismes d'action (génétique, moléculaire, cellulaire, tissulaire). Équipe multidisciplinaire.

  • Objectifs : Nouvelle cible, PK, métabolisme. Modèles in vitro, in vivo.

• Clinique : Répondre à une interrogation clinique à large échelle (ex: études PK chez patients, pharmacovigilance).

• Pharmacovigilance en Recherche : Utilisation de bases de données (connaissances paracétamol).

3. Exemple de Recherche Fondamentale : Rapamycine et Arthrose

• Équipe BioReMaTCh (scientifiques, chirurgiens orthopédiques, rhumatologues, pharmacologues).

• Utilisation de prélèvements humains (cartilage, synoviale).

• Modèles : 2D/3D (biomatériaux), organes sur puce. Modèle in vivo (rat - ligament croisé antérieur).

• Marqueurs : anaboliques/cataboliques, génétiques.

• Rapamycine (sirolimus) : immunosuppresseur, bloque mTOR (impliqué dans processus cellulaires), restaure l'autophagie (diminuée dans arthrose).

• Objectif : Optimiser l'usage intra-articulaire de la rapamycine.

• Axes :

  • Axe 1 : Évaluer cytotoxicité (chondrocytes, synoviocytes, CSM) et effets chondrogéniques. Concentration-dépendante. Hypoxie: effet protecteur.

  • Axe 2 : Pharmacocinétique, développement de nanoparticules à libération prolongée (pour éviter toxicité systémique).

  • Axe 3 : Évaluer in vivo sur modèles de rats (arthrose diffuse/focale).

4. Exemple de Recherche Post-Clinique : Étude CAUSAMAP (Cannabis de synthèse)

• Identification et caractérisation consommation cannabis/cannabinoïdes de synthèse (CDS) en Lorraine.

• Addictovigilance, pharmacoépidémiologie, toxicologie analytique.

• CDS : Molécules de synthèse, stimulant récepteurs cannabinoïdes (CB1: psychotropes; CB2: immunomodulateurs). Plus puissants que cannabis. Non détectables par tests classiques.

• Objectifs : Dépistage urinaire, caractérisation consommation.

• Méthodes : Recueil données (joints/semaine), urines (CDS, THC-COOH).

• Résultats : Pas de CDS chez consommateurs chroniques. Corrélation joints/semaine et THC-COOH. Seuil de 15 joints/semaine.

• Discussion : Phénomène "Spice" (CDS) concerne jeunes non chroniques.

5. Exemple de Recherche Clinique : Étude GRAAL (Grêle Court et Absorption des Antibiotiques)

• Question clinique : absorption des antibiotiques per os chez patients avec syndrome du grêle court (SGC).

• Collaboration nutritionnistes, infectiologues, pharmacologues.

• Problème : patients SGC ont problèmes d'absorption. Souvent IV, mais long séjour. Objectif : relai IV à PO.

• Pharmacocinétique impliquée.

• Objectifs : Évaluation absorption (biodisponibilité IV vs PO). Patient = son propre témoin.

• Étude pilote, monocentrique. Reste le manque de patients.

6. Exemple de Recherche Post-Clinique : Étude sur l'Usage du Paracétamol

• Pharmacovigilance sur le paracétamol. Augmentation des intoxications.

• Objectif : Connaissance du public (bon usage, surdosage, facteurs de risque).

• Méthode : Étude prospective observationnelle descriptive. Questionnaire (score) chez patients en salle d'attente MG.

• Technique capture-recapture : Évaluation prévalence du surdosage involontaire (20% en population générale).

• Conclusion : Connaissances insuffisantes, besoin d'éducation thérapeutique.

VIII. Recherche Translationnelle et Maladies Rares

1. Recherche Translationnelle (RT)

• Transfert des découvertes scientifiques (labo, clinique, épidémio) directement au patient.

• Accélérer la valorisation scientificique.

• Défis : Non-transfert fréquent (peu de découvertes fondamentales atteignent la clinique). Obstacles industriels (fabrication d'outils) et réglementaires (essais cliniques).

• Nécessite collaboration multidisciplinaire (fondamentalistes, cliniciens, physiciens, mathématiciens, IA).

• Le "gap" entre recherche et clinique : les cliniciens chercheurs adaptent mieux leurs découvertes.

2. Maladies Rares

• Individuellement rare, mais collectivement fréquente (446 millions personnes).

• Définition variable : Ex: aux USA < 200 000 sujets, en Europe < 5/100 000 sujets.

• Approche traditionnelle ("un gène, une maladie") simpliste. Un variant génétique peut avoir différents phénotypes.

• Gène, protéine, fonction : Dogme parfois trop simple ; épissages alternatifs, modifications post-traductionnelles.

• Exemple : Phénylcétonurie (phénylalanine hydroxylase). Dépistage néonatal important. Effet variable selon les individus (frères/sœurs).

3. Étude des Maladies Rares

• Méthodologies : Génomique (ADN), fonctionnelle (phénotype), métabolomique (petites molécules, spectrométrie de masse).

• Bases de données dédiées (maladies rares parfois très individuelles).

• Approche ciblée (tissu, cellule, voie métabolique) ou globale (transcriptome).

4. Exemple : Résistance à l'Hormone de Croissance

• Enfants ne grandissent pas, taux GH/IGF-1 normaux.

• Implique voie de signalisation (Ras/MAPK, PI3K/AKT). Facteur clé : STAT5b (facteur de transcription).

• Mutations de STAT5b : p.A630P et p.F646S.

• Études in vitro (lignée HEK293) : protéines mutées phosophorylées mais n'entrent pas dans le noyau.

• Electrophoretic Mobility Shift Assay : Protéine mutée n'arrive pas à se lier à l'ADN.

• Défaut biochimique : accumulation de protéines mutées dans le cytoplasme.

• Modélisation 3D : Impact du variant muté sur stabilité du domaine SH2.

IX. Modifications Épigénétiques

1. Introduction

• Lien entre environnement et gènes. L'environnement modifie l'expression des gènes sans changer la séquence nucléotidique.

• Transmission transgénérationnelle (alimentation, activité physique, chimie).

2. Génétique et Épigénétique

• Mutations génétiques : Changement séquence nucléotidique, effets délétères possibles.

• Épimutations : Pas de changement séquence, mais addition groupements chimiques (modifie expression gène). Non détectées par la cellule, peuvent être transmises.

• Exemple caricatural : chocolat et Prix Nobel (corrélation avec PIB).

3. Reprogrammation Fœtale

• Le fœtus s'adapte à son environnement in utero. Si l'environnement change post-natal, risque de maladies chroniques (syndrome métabolique, maladies cardiovasculaires).

• La vie intra-utérine et paternelle influencent l'expression des gènes.

• Exemple : Régime pauvre en calories mère => diminution cellules B pancréas, risque diabète.

• Hypothèse du phénotype économe (Barker) : Adaptations métaboliques précoces, croissance fœtale réduite => maladies chroniques (coronariennes, diabète, HTA).

• Famine néerlandaise (1944-1945) : Exposition mi-gestation/fin gestation => faible poids naissance F1. F1 adulte => altération tolérance au glucose, résistance insuline. Diminution méthylation de IGF2.

• L'environnement modifie le phénotype via épigénétique (sans changer séquence ADN). Mémoire cellulaire transmise aux générations.

• Une femme enceinte soumise à un facteur environnemental expose 3 générations simultanément (elle-même, fœtus, cellules germinales du fœtus). Il faut 4 générations pour confirmer effet transgénérationnel.

• Le phénotype résulte de l'interaction entre environnement, génétique et épigénétique (Ex: jumeaux monozygotes, fumeuse/non-fumeuse).

4. Mécanismes Épigénétiques

• Méthylation de l'ADN :

  • Cytosine se transforme en 5-méthylcytosine par ADN méthyltransférase (DNMT).

  • Le groupement méthyl provient de SAM (S-adénosylméthionine), lui-même de la vitamine B9 (folates).

  • Ne peut être méthylée que si elle est dans un dinucléotide CG (îlots CpG).

  • Hyper-méthylation d'un promoteur inhibe l'expression des gènes. Déméthylation active les gènes.

  • DNMT1 : méthylation de maintenance (division cellulaire).

  • DNMT3a et 3b : méthylation de novo.

• Déméthylation de l'ADN :

  • Pas de déméthylase directe. Enzymes TET transforment CH3 en hydroxyméthyl (5-hmC).

  • TET nécessite Fer 2+, oxygène, 2-cétoglutarate (cycle de Krebs), Vitamine C. Lien étroit entre métabolisme/alimentation et épigénétique.

• Profils de méthylation : Majorité CpG hors îlots hyperméthylés. Îlots CpG non méthylés (promoteurs, gènes régulateurs). Séquences répétitives hyperméthylées.

• Méthylation dynamique : Reprogrammation épigénétique lors du développement (cellules germinales, embryon précoce).

5. Modifications des Histones

• Histones H2A, H2B, H3, H4 (octamère), ADN s'enroule. Extrémité N-ter riche en Lysine (K), Arginine (R).

• Modifications chimiques : méthylation, acétylation (lysine), phosphorylation (thréonine, sérine).

• Ces modifications créent de nouveaux épitopes lus par protéines régulatrices (bromodomaine (BD) pour acétylation, chromodomaine (CD) pour méthylation).

• Ces modifications sont réversibles (histone acétyltransférase, désacétylase).

• Code des histones : Combinaisons de modifications formant une "phrase" pour la cellule.

• Marques activatrices : Méthylation H3K4, H3K79. Acétylation des histones (supprime charge +, décompaction ADN => facilitation transcription).

• Marques répressives : Méthylation H3K9, H3K27.

• Lien étroit avec métabolisme : Acétyl-CoA (glycolyse, B-oxydation) pour acétylation. NAD+ (phosphorylation oxydative) pour désacétylation.

6. Interférence par l'ARN

• ARN courts double brin non-codants : miRNA (endogènes) ou siRNA (exogènes).

• Synthèse : pri-miRNA (noyau) => pré-miRNA (par Drosha) => cytoplasme => ARN double brin (par Dicer).

• Complexe RISC garde brin anti-sens qui se fixe sur ARNm cible complémentaire.

• Provoque : Dégradation de l'ARNm, empêchement de la traduction, ou inhibition transcription (si fixation sur promoteur).

• Mode de régulation post-transcriptionnel.

7. Techniques d'Étude

• Bisulfite Sequencing (méthylation ADN) :

  • ADN traité avec bisulfite : cytosine méthylée reste inchangée, non méthylée transformée en uracile (puis thymine après PCR).

  • Comparaison avec ADN non traité pour identifier les cytosines méthylées ou non.

  • Avantages : Cartographie de l'état de méthylation des îlots CpG.

• ChIP (Chromatin Immunoprecipitation - modifications histones) :

  • Fixation protéines/ADN (formaldéhyde).

  • Fragmentation de la chromatine.

  • Incubation avec anticorps spécifiques des modifications histones.

  • Immunoprécipitation pour enrichir l'ADN associé à la modification.

  • Séquence pour identifier les gènes porteurs de la modification.

• Exemple des souris Agouti :

  • Gène Agouti (A) pour poil marron, (a) pour noir. Gène Avy pour poil jaune (résistance insuline, diabète, surpoids, tumoral).

  • Rétrotransposon avec îlots CpG peut s'insérer dans gène A, activant expression Avy.

  • Régime riche en donneurs de méthyl (chez souris Avy) => hyperméthylation rétrotransposon => Avy non exprimé => poil marron.

  • L'alimentation joue un rôle majeur sur le phénotype via l'épigénétique.

X. Recherche en Imagerie

1. Histoire de l'Imagerie Médicale

• De l'observation qualitative à l'analyse quantitative (organe => tissu => cellule => molécule).

• Trois forces motrices : applications cliniques, avancées industrielles, gestion des risques.

• Développement récent : approche open source (ex: EXPLORER consortium).

• Imagerie moléculaire multimodale dans le développement de médicaments (identification cibles, criblage, optimisation, suivi maladie).

• Études précliniques (animaux) pour tester médicaments et dispositifs.

2. Connaissances de Base en Imagerie

• Éléments : imagerie (détection signaux), stockage (DICOM, Big Data), visualisation (2D, 3D, RA), analyse (post-traitement), biomarqueurs (apprentissage auto), procédures interventionnelles.

• IA en radiologie : Optimisation diagnostic, prédiction, acquisition, analyse.

• Image : Représentation grandeurs physiques variables dans l'espace. Continue/discrète, 2D/3D/4D/5D (3D + temps).

• Nombres complexes : Images médicales en IRM (amplitude, phase).

• Niveaux de gris : Histogramme pour distribution intensités. Seuillage pour séparation premier/arrière-plan.

• Contraste : Capacité à distinguer les différences d'intensité.

• Couleur : Artificielle en imagerie médicale (RGB, CMKY, HSV).

• Éléments pour l'IA : Grandes quantités de données (qualité, représentativité), modèle générique/affiner, explicable.

3. Dispositifs d'Imagerie Médicale

• Rayons X : Radiographie (2D), fluoroscopie (temps réel), TDM (CT) 3D (reconstruction d'images 2D).

  • Échelle Hounsfield (HU) : Eau=0, Air=-1000. 5 densités de rayons X.

  • Recherche : résolution, effet des radiations (faibles doses), contraste de phase.

• IRM (Magnetic Resonance Imaging) :

  • Génère champ magnétique. Composants : aimant, bobines (récepteur/émission). Bobines flexibles (GE AIR).

  • Données brutes (K-space), amplitude (DICOM), phase (contraste de phase).

  • Interventionnel : guidage (cardiologie, chirurgie pédiatrique).

• Ultrasons : Bases physiques (passage rapide par la prof).

• PET et SPECT (Médecine Nucléaire) :

  • Traceurs moléculaires, radionucléides émetteurs de positrons.

  • SPECT : moins cher, résolution inférieure, anatomie instable.

  • PET : FDG (traceur glucose au fluor 18).

  • Problèmes : résolution, effets de volume partiel, quantification. Fusion (CT-PET, MR-PET).

• Radiomique :

  • Extraction, analyse, modélisation de caractéristiques d'images pour prédiction (caractéristiques génomiques, stades cliniques).

  • Limitations : Manque utilité clinique, reproductibilité, validation.

  • Caractéristiques : forme (volume), premier ordre (histogramme), deuxième ordre (texture), plus haut ordre (ondelette).

  • IBSI (Image Biomarker Standardization Initiative) : Directives pour la normalisation.

  • Big Data : Biobanque d'images (UK Biobank - 500 000 participants).

  • Partage de données : Méta-analyse basée sur l'image (IBMA) pour plus de fiabilité.

• Imagerie Optique.

• Spectroscopie Fonctionnelle Proche Infrarouge : Méthode non invasive pour l'hémodynamique cérébrale (oxy-Hb, désoxy-Hb).

• Imagerie Photo-acoustique : Comprend activité cérébrale, détection cancer. Combine optique et son.

XI. Recherche Clinique (Essais Cliniques)

1. Pourquoi Faire des Essais Cliniques ?

• Évaluer efficacité, tolérance d'une méthode/traitement.

• Études randomisées et comparatives sur sujets malades.

• Exemple : Apnée du sommeil et insuffisance cardiaque. Études de cohorte (HR=0.7) => Essai clinique (HR=1.13, augmentation du risque de décès).

• Démarche critique pour avancer la médecine.

• Répondre à 2 questions : Bénéfice fiable ? Bénéfice pertinent ?

2. Biais et Erreurs en Recherche

• Biais : Erreur systématique (sélection, mesure, confusion) qui altère la valeur réelle de l'effet.

• Erreur aléatoire : Liée aux fluctuations d'échantillonnage, affecte la précision mais pas l'estimation (diminuée en augmentant taille échantillon).

• Comité d'adjudication : Harmonise et standardise l'évaluation des critères de jugement.

• Mortalité toutes causes : critère objectif.

3. Parer aux Biais

• Randomisation : Tirage au sort pour répartir aléatoirement les biais connus et inconnus. Peut être non efficace pour petits effectifs. Ne couvre pas les biais de mesure.

• Différence de résultats : Moins de biais dans les essais cliniques (interprétation moins biaise). Étude en "one shot" vs cohortes plus souples.

• Aveugle (simple ou double) : Assurer prise en charge similaire, éviter influence médecins/patients.

• Exemple : Dénervation rénale pour HTA. Sans aveugle (-32 mmHg TA), double aveugle (-2 mmHg TA). L'aveugle est crucial pour la validité.

4. Facteurs Confondants

• Régression à la moyenne : Normalisation des données vers la moyenne. Présente même avec randomisation (mais équilibrée entre groupes). Nécessité d'un groupe contrôle.

• Effet placebo : Bénéfice en dehors de l'effet biologique. Important en clinique, parasite en expérimentation.

5. Détermination de l'Effectif

• P-value : Probabilité d'observer un résultat par hasard s'il n'y a pas d'effet. Seuil habituel 5%. Arbitraire.

• Puissance : Probabilité de mettre en évidence une différence réelle.

• Taille d'effet : Cliniquement pertinent ? Échelle multiplicative (RR) ou additive (RAR). Le NST (Nombre de Sujets à Traiter) quantifie l'intérêt clinique.

6. Système de Gradation de Preuve et Recommandations

• Preuve scientifique établie par essais cliniques (niveau de preuve I pour ECR).

• Force de recommandation dépend du niveau de preuve.

• En l'absence de preuve : accord d'experts (>80%).

7. Transposabilité Clinique

• Question de l'efficacité du traitement sur une large population versus échantillon sélectionné.

• Identifier l'effet dans conditions "pures" et voir si applicable dans conditions moins pures.

XII. Méthodologie de la Recherche Chirurgicale (Suite)

1. Difficultés

• Financement : Recherche chirurgicale très coûteuse, difficile à financer (peu d'appels dédiés).

• Valorisation scientifique : Publications chirurgicales moins "impactantes".

• Temps disponible : Chirurgiens surchargés.

• Unités de recherche : Moins nombreuses et spécifiques.

2. Biais (Exemples)

• Biais de sélection (le plus fréquent) : Patients non comparables entre groupes. Solutions : randomisation (difficile en chirurgie), stratification.

• Biais liés aux différences entre centres (protocoles, équipements). Solutions : Harmonisation, protocoles détaillés.

• Biais liés aux différences entre chirurgiens (techniques, habitudes).

• Biais de performance : Lié à la fatigue, communication d'équipe.

• Biais de suivi : Perte de vue des patients (pas d'intérêt à revenir). Solution : études prospectives.

• Biais d'évaluation : Effet placebo, subjectivité. Solutions : double aveugle (difficile), séparer effecteur/évaluateur, critères objectifs, vidéos.

• Biais liés aux courbes d'apprentissage : Les premières interventions d'une nouvelle technique sont biaisées.

3. Difficulté de Comparaison avec Traitements Médicaux

• Les deux approches sont très différentes et non exclusives (ex: traitement médical pour retarder chirurgie).

4. Retour d'Expérience (Thèse sur Adénocarcinomes Nasaux)

• Sujet : Adénocarcinomes nasaux chez les menuisiers (rare, poussière de bois).

• Hypothèse : Déméthylation promoteur CDX2 => surexpression.

• Méthode : Étude prospective, 3 groupes (sains, exposés, tumeurs). Prélèvements : biopsies, brossages.

• Résultats : Profil spécifique des patients avec tumeur. Surexpression CDX2 dans tumeurs et côté controlatéral (susceptibilité). Baisse activité ciliaire, hausse réplication.

• Conclusion : Nouveaux gènes cibles. Reprogrammation oncogénique. Brevet déposé pour diagnostic non invasif.

XIII. Cytomique

1. Définition et Généralités

• Évaluation des rapports fonctionnels entre la Cellule (Cytome) et les voies métaboliques (Métabolome) dépendantes des protéines (Protéome), sous contrôle génétique (Génome) et/ou épigénétique (Transcriptome).

• Unité minimale de fonction : la cellule.

• S'intéresse aux liens entre technologie et biologie fonctionnelle.

• Outils : Cytométrie en flux, imagerie cellulaire (microscopie conventionnelle, confocale, électronique).

2. Exemples d'Utilisation en Biologie Médicale

• Tests IGRAs (détection tuberculose latente) : Recherche réponse immunitaire (lymphocytes T mémoire) plutôt que pathogène.

  • Méthode : Culture cellulaire + peptides du bacille de Koch => production interféron-gamma (IFN-ɣ) par lymphocytes activés.

  • Quantification IFN-ɣ par ELISA, ELISPOT, marquage intracellulaire.

  • ELISPOT : Très haute sensibilité (1/10^5 cellules). Donne nombre cellules spécifiques et quantité produite. Limites : Reproductibilité, pas de phénotype cellulaire direct.

3. Immunomonitoring

• Suivi quantitatif des cellules immunocompétentes (après greffe, déficits immunitaires).

• Utilisation des CD (Clusters de Différenciation) : Structures membranaires/intracellulaires reconnues par anticorps. Permet d'identifier familles de cellules (lymphocytes T/B, cellules dendritiques).

• Exemple : Mesure CD4/CD8 dans infection VIH.

4. Cytométrie en Flux

• Détection de cellules en suspension marquées par fluorochromes.

• Étapes : Passage en flux, excitation laser, détection signaux optiques, traitement informatique.

• Composants : Fluidique, optique, électronique (photomultiplicateur).

• Présentation des données : Nuage de points (dot plot) ou densité (density plot). Chaque point = 1 cellule.

• Cytomètre en flux trieur : Sépare les cellules (positives/négatives) selon la fluorescence détectée (champ électrique).

• Informations fournies : Taille (FSC), granularité (SSC), intensité fluorescence (MFI).

5. Fluorescence

• Un fluorochrome absorbe énergie laser, s'excite et réémet photons à une longueur d'onde donnée.

• Intensité de marquage proportionnelle au nombre de sites de liaison de l'anticorps.

• Choix judicieux des fluorochromes (brillants pour antigènes faiblement exprimés) et lasers.

• Applications : comptage cellulaire, immunophénotypage, analyse cycle cellulaire, apoptose, cytokines.

• Réponse immune et mémoire : identification LT mémoires par marqueurs (CD45RA, CCR7).

6. Évaluation Fonctionnelle des Lymphocytes Spécifiques de l'AG

• Culture cellulaire avec peptides : stimulation lymphocytes T CD4+/CD8+. Production de cytokines (bloquée par BFA).

• Cytométrie en flux multiparamétrique : Phénotypage surface, marquages intracellulaires cytokines, CD107a (cytotoxicité).

• Prolifération (CFSE) : Mesure dilution de CFSE (fluorescence divisée à chaque division cellulaire).

• Exemple : Cellules polyfonctionnelles (produisant plusieurs cytokines) sont les plus protectrices.

7. Cytomètre Imageur : ImageStream X® Amnis

• Combine cytométrie en flux et imagerie photonique. Observation directe avec localisation précise.

• Avantages : Jusqu'à 1000 cellules/sec, 12 canaux image/cellule.

• Images capturées par caméras (non photomultiplicateurs).

• Analyse de localisation précise (fluorescence, pixels) => taille, forme, texture, localisation.

• Applications : Translocation NF-kB (noyau), changement forme monocytes.

8. Cellsearch System Veridex

• Étude des cellules tumorales circulantes (CTC) rares.

• Pronostic patients corrélé au nombre de CTC.

• Technologie approuvée par FDA (cancers sein, prostate, colon métastatiques).

• Principe : Enrichissement immunomagnétique (anticorps anti-EpCAM) => Marquage spécifique (DAPI pour noyau, CK pour cytokératine, CD45 pour leucocytes).

• Différenciation leucocyte sain (CD45+) vs cellule tumorale (CK+, EpCAM+).

• Applications : Cancer (LCR, épanchements), CECs, CMCs, suivi marqueurs tumoraux.

XIV. Réflexes et Sensations Respiratoires

1. Fonction Essentielle du Système Respiratoire

• Assurer échanges gazeux, assurer qualité air inspiré (humidification, réchauffement, purification).

• Mécanismes de défense : non réflexes (ascenseur mucociliaire, barrières), réflexes (réponse prompte).

2. Réflexes Respiratoires

• Réponse musculaire stéréotypée, involontaire, immédiate à un stimulus.

• Passifs (protection/prévention) : Apnée, constriction laryngée, bronchoconstriction (empêchent inhalation).

• Actifs (défense) : Éternuement (muqueuse nasale), reniflement (naso-pharynx), toux (larynx, trachée, bronches), réflexe expiratoire (trachée, bronches).

• Dépend de la taille des particules et du site de dépôt dans les voies aériennes.

3. Toux

• Expulsion rapide d'air avec son caractéristique.

• 3 phases : inspiration profonde, fermeture glotte, expiration maximale.

• Toux réflexe : Physiologique, défense, élimine particules.

• Toux symptôme : Liée à maladies respiratoires (infection, asthme), disparait avec la maladie.

• Toux maladie : Chronique, hypersensibilité, persiste malgré traitement. Liée à dysfonctionnement voies nerveuses.

• Mécanismes : Stimulation directe récepteurs (mécanique, chimique), hyperréactivité tussigène (hypertussie, dystussie).

4. Méthodes d'Études de la Toux

• Objectif : Clarifier mécanismes (réflexe => maladie), développer thérapies.

• Boucle réflexe de la toux (involontaire) : Voies afférentes (fibres Aδ, fibres C via nerf vague) => Tronc cérébral => Voies efférentes (alpha motoneurones).

• Voie volontaire (cortex) et modulation corticale.

• Fibres Aδ (ganglion nodose) : mécanorécepteurs bas seuil, toux utile.

• Fibres C (ganglion jugulaire) : polymodaux haut seuil, sensation irritation, toux comportementale.

5. Recherches Précliniques de la Toux

• Modèles animaux : Cochon d'Inde, chat, lapin (rats/souris n'ont pas de réflexe de toux).

• Techniques : Enregistrement potentiels d'action d'une seule fibre (in vivo, ex vivo).

  • In vivo : isole nerf vague (anesthésié). Clarifie physiologie.

  • Ex vivo : isole voie aérienne inférieure + nerf vague. Étudie propriétés pharmacologiques.

  • Identifie canaux ioniques (TRPV1, ASICs, Piezo Channels) comme cibles thérapeutiques.

• Recherche réflexe complète : afférente, centrale, efférente. Enregistrement toux (débit aérien, EMG diaphragme/abdominaux, pressions).

• Contrôle sous-cortical/cortical : Modèle animal vigile (naïf vs asthmatique). Pléthysmographie pour mesurer volumes pulmonaires.

• Enregistrement sonore + transformation de Fourrier pour différencier toux/éternuement.

6. Recherches Cliniques de la Toux : Méthodes Objectives

• Mesure sensibilité aux agents tussigènes (capsaïcine, acide citrique) : C2 (2 toux), C5 (5 toux). Détecter hypersensibilité.

• Étude du son de la toux (enregistreur ambulatoire, logiciel).

• VAS (Visual Analogue Scale) : Échelle subjective (0-100) pour évaluer qualité de vie. Utile avec mesure objective.

• Complexité de la régulation de la toux. Comprendre les zones cérébrales impliquées dans la toux chronique excessive.