Bacterial Typing Methods and Classification

Typage Bactérien : Méthodes et Applications

Le typage moléculaire des bactéries vise à établir le lien de parenté entre des isolats appartenant à la même espèce. C'est un outil essentiel en épidémiologie pour discriminer les souches bactériennes, confirmer ou exclure des épidémies, suivre les souches résistantes ou virulentes, et évaluer l'efficacité des mesures de contrôle des infections.

Objectifs et Contexte du Typage

Le typage est une composante cruciale dans l'investigation des épidémies. Il permet de répondre à plusieurs questions fondamentales :

• Lien épidémiologique : Les isolats de différents patients sont-ils clonalement apparentés, suggérant une source commune ou une transmission ?

• Surveillance : Permet d'identifier et de suivre l'émergence et la dissémination de souches particulièrement virulentes ou résistantes aux antibiotiques.

• Investigation d'épidémie : Confirme ou exclut le lien clonal entre les isolats liés à une épidémie et ceux qui ne le sont pas.

• Suivi clinique : Pour un même patient, permet de déterminer si une nouvelle infection est une rechute (même souche) ou une ré infection (nouvelle souche).

Pour la surveillance épidémiologique, il est essentiel de pouvoir différencier de manière rapide et fiable les isolats bactériens apparentés.

Classification des Méthodes de Typage

Les approches de typage peuvent être classées de plusieurs manières.

1. Selon l'Objectif

• Typage comparatif : Analyse simultanée des isolats liés à une épidémie et des isolats non liés. Cette méthode est satisfaisante pour les investigations d'épidémies locales et limitées dans le temps.

• Typage définitif (de bibliothèque) : Vise à générer des données de haute qualité, détaillées et standardisées, collectées dans une base de données unifiée. Ces données peuvent être consultées à tout moment, par différents chercheurs et dans différents laboratoires, permettant des comparaisons à grande échelle et à long terme.

2. Selon la Nature de la Méthode

Méthodes de Typage Phénotypiques (Non Moléculaires)

Ces méthodes décrivent les produits de l'expression des gènes pour distinguer les souches bactériennes. Elles nécessitent généralement une connaissance préalable de l'espèce bactérienne, à l'exception notable de la spectrométrie de masse MALDI-TOF qui peut réaliser l'identification et le typage simultanément.

Sérotypage

Le sérotypage identifie et différencie les souches bactériennes en fonction de l'expression différentielle de déterminants antigéniques à leur surface (ex: polysaccharides capsulaires, lipopolysaccharides, protéines). Ces variations définissent les sérotypes ou sérovars.

• Exemple 1 : Salmonella

  • Le nom scientifique est souvent abrégé pour inclure le sérotype. Par exemple, Salmonella enterica sous-espèce enterica sérotype Typhi est simplement appelée Salmonella Typhi.

• Exemple 2 : Streptococcus (Classification de Lancefield)

  • Les streptocoques sont classés en groupes (A, B, C, D, etc.) en fonction des antigènes glucidiques de leur paroi.

  • Groupe A : S. pyogenes

  • Groupe B : S. agalactiae

  • Groupe D : Enterococcus (anciennement classé ici)

Lysotypie (Phage Typing)

La lysotypie exploite la haute spécificité d'hôte des bactériophages (virus infectant les bactéries). Les phages lytiques n'infectent que certaines espèces, voire certaines souches, de bactéries.

1. Principe du cycle lytique : Le phage se lie à la bactérie, injecte son matériel génétique, se réplique, puis assemble de nouveaux virions, provoquant la lyse (destruction) de la cellule bactérienne et la libération de nouveaux phages.

2. Procédure :

   1. Une culture de la bactérie à typer est étalée sur une boîte de Pétri pour former un "tapis" bactérien.

   2. Différentes suspensions de phages connus sont déposées sur des zones spécifiques de la plaque.

   3. Après incubation, la formation de plages de lyse (zones claires où les bactéries ont été détruites) indique la sensibilité de la souche bactérienne à ce phage particulier.

3. Interprétation : Le profil de sensibilité (ou résistance) d'une souche à un panel de phages standardisés définit son lysotype. Les souches ayant le même lysotype sont considérées comme apparentées.

Méthodes de Typage Génotypiques (Moléculaires)

Ces méthodes sont devenues la norme en raison de leur plus grande reproductibilité et de la possibilité de créer des bases de données de référence. Elles se divisent en plusieurs grandes catégories.

Méthodes Basées sur l'Amplification (sans séquençage)

1. Typage Plasmidique et PBRT

Typage plasmidique : Les plasmides sont des éléments génétiques extrachromosomiques mobiles qui peuvent être acquis, perdus ou transférés entre souches. Analyser leur présence et leur taille peut servir de marqueur épidémiologique.

• Inconvénient : Le contenu plasmidique manque de stabilité, ce qui limite la fiabilité de cette méthode pour des études à long terme.

PBRT (PCR-Based Replicon Typing) : Une méthode PCR qui cible les gènes de réplication (réplicons) spécifiques des principales familles de plasmides.

• Application : Largement utilisé pour déterminer la dispersion de gènes de résistance aux antibiotiques. En combinaison avec le profil de résistance, il permet d'évaluer si un gène de résistance est porté par un plasmide transférable.

• Exemple : Une étude a montré une corrélation entre la production de la carbapénémase KPC associée à un pic de 11 109 Da en MALDI-TOF et la présence d'un plasmide de type FII. Les souches KPC qui ne présentaient pas ce pic étaient négatives pour le plasmide FII, comme confirmé par PBRT.

2. RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA)

La RAPD est une méthode PCR qui utilise des amorces courtes (typiquement 10 bases) et de séquence arbitraire.

• Principe : L'amplification est réalisée à basse température d'hybridation, ce qui permet aux amorces de se lier à de multiples sites non spécifiés sur le génome. Les fragments amplifiés sont ensuite séparés par électrophorèse.

• Interprétation : Les profils de bandes varient en fonction de mutations dans les sites de liaison des amorces (absence de bande), ou d'insertions/délétions entre les sites de liaison (changement de taille de bande).

• Avantages : Simple, rapide, peu coûteux, et ne nécessite aucune connaissance préalable de la séquence d'ADN.

• Inconvénients : Faible reproductibilité inter-laboratoires due à la sensibilité aux variations de réactifs et d'équipements. Pouvoir discriminant inférieur à celui du PFGE. Les bandes sont souvent nombreuses et difficiles à analyser.

3. rep-PCR (Repetitive-Element Polymerase Chain Reaction)

La rep-PCR cible des séquences d'ADN répétitives non codantes (comme les éléments REP, ERIC, BOX) dispersées dans le génome bactérien.

• Principe : Des amorces conçues pour s'hybrider à ces éléments répétitifs sont utilisées pour amplifier les régions d'ADN situées entre deux éléments adjacents. Le nombre et la taille des amplicons dépendent du nombre et de la distribution de ces éléments.

• Avantages : Facile, rapide, nécessite une quantité minimale d'ADN.

• Inconvénients : Reproductibilité relativement faible et manque de plateformes standardisées.

4. MLVA (Multilocus VNTR Analysis)

La MLVA analyse les VNTR (Variable Number of Tandem Repeats), qui sont des régions du génome contenant des motifs de séquence d'ADN répétés en tandem. Le nombre de répétitions à plusieurs loci (emplacements) dans le génome est très variable entre les souches.

• Principe : Une PCR multiplex est utilisée pour amplifier simultanément plusieurs loci VNTR sélectionnés. Les fragments sont ensuite séparés et leur taille est mesurée pour déterminer le nombre de répétitions à chaque locus.

• Interprétation : La combinaison du nombre de répétitions à chaque locus forme un code numérique (ex: 5-3-7-4) qui définit le type MLVA de la souche.

• Avantages : Technique rapide, peu coûteuse et peut parfois être réalisée directement à partir d'échantillons cliniques.

• Inconvénients : N'est pas un outil universel, car des amorces spécifiques doivent être conçues pour chaque espèce. La reproductibilité n'est pas parfaite.

Méthodes Basées sur des Fragments de Restriction

PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis / Électrophorèse en Champ Pulsé)

Longtemps considérée comme la "méthode de référence" (gold standard) pour le typage moléculaire, le PFGE offre une haute résolution pour comparer des génomes entiers.

• Principe : L'ADN génomique purifié est digéré par une enzyme de restriction "à coupe rare", qui ne coupe l'ADN qu'en quelques sites. Cela génère de très grands fragments d'ADN (jusqu'à plusieurs mégabases).

• Séparation : Ces grands fragments sont séparés sur un gel d'agarose par une électrophorèse en champ pulsé. Le champ électrique change périodiquement d'orientation, forçant les grands fragments d'ADN à se réorienter et à migrer à des vitesses différentes en fonction de leur taille.

• Interprétation : Le profil de bandes obtenu est caractéristique de la souche. Selon les critères de Tenover, les souches sont considérées comme :

  • Clonalement identiques : Même profil de bandes.

  • Étroitement apparentées (closely related) : Différence de 2-3 bandes.

  • Possiblement apparentées (possibly related) : Différence de 4-6 bandes.

  • Non apparentées (unrelated) : Différence de 7 bandes ou plus.

• Avantages : Haut pouvoir discriminant, excellente reproductibilité intra-laboratoire, bonne concordance épidémiologique.

• Inconvénients : Technique longue (plusieurs jours), laborieuse et nécessite une grande quantité d'ADN de haute qualité. La reproductibilité inter-laboratoires peut être difficile sans protocoles standardisés (ex: PulseNet).

• Exemple d'application : Investigation d'une épidémie hospitalière de Pseudomonas aeruginosa produisant la métallo-β-lactamase VIM-1. Le PFGE a révélé que 7 des 8 isolats étaient clonalement apparentés, confirmant une transmission nosocomiale.

Méthodes Basées sur le Séquençage

Ces méthodes offrent une résolution et une portabilité des données inégalées, car les séquences nucléotidiques sont univoques et peuvent être comparées via des bases de données internationales.

1. SLST (Single Locus Sequence Typing)

Le SLST se base sur le séquençage d'un seul gène ou d'une région génique, choisi pour sa haute variabilité.

• emm typing pour Streptococcus pyogenes (GAS) :

  • Cible le gène emm, qui code pour la protéine M, un facteur de virulence majeur.

  • Le séquençage d'environ 150 paires de bases à l'extrémité 5' du gène permet de définir le type emm.

  • Des bases de données (ex: CDC) permettent d'assigner les types et de suivre l'épidémiologie mondiale des souches de GAS invasives.

• spa typing pour Staphylococcus aureus :

  • Cible la région X polymorphe du gène spa, qui code pour la Protéine A, un facteur de virulence qui se lie aux anticorps IgG.

  • Cette région est composée de répétitions de 24 paires de bases. L'ordre et le type de ces répétitions définissent le type spa.

  • La base de données Ridom SpaServer est une ressource centralisée pour l'assignation et la comparaison des types spa, ce qui a grandement harmonisé la nomenclature.

2. MLST (Multi-Locus Sequence Typing)

Le MLST est une méthode de typage basée sur le séquençage de fragments internes (400-600 pb) de plusieurs gènes de ménage (housekeeping genes, typiquement 6 à 10). Ces gènes codent pour des fonctions cellulaires essentielles et évoluent lentement.

1. Principe : Pour chaque gène, les différentes séquences trouvées sont assignées à des numéros d'allèles distincts.

2. Profil Allélique : La combinaison des numéros d'allèles pour tous les loci définit le profil allélique de la souche.

3. Sequence Type (ST) : Chaque profil allélique unique se voit attribuer un numéro de Sequence Type (ST).

• Avantages : Hautement reproductible et portable. Les données (ST) sont non ambiguës et peuvent être facilement partagées et comparées via des bases de données en ligne (ex: PubMLST). Fournit des informations sur les relations évolutives (lignages clonaux).

• Inconvénients : Coût et charge de travail élevés. Moins adapté pour le typage de routine lors d'investigations d'épidémies rapides en raison du temps nécessaire.

Nouvelles Approches : Spectroscopie Infrarouge à Transformée de Fourier (FTIR)

La FTIR est une méthode phénotypique rapide et à haut débit qui analyse la composition moléculaire globale d'une cellule bactérienne.

• Principe : La technique mesure l'absorption de la lumière infrarouge par les molécules des cellules (lipides, protéines, acides nucléiques, polysaccharides). Chaque composé vibre à des fréquences spécifiques, générant un spectre d'absorption unique qui sert d'empreinte digitale (fingerprint) biochimique pour la souche.

• Application au typage : En se concentrant sur des régions spécifiques du spectre, notamment la région des polysaccharides (environ 900-1200 cm⁻¹), il est possible de détecter des différences subtiles entre les souches et d'évaluer leur relation clonale.

• Analyse des données : Les spectres sont comparés à l'aide d'analyses statistiques avancées comme l'analyse en composantes principales (PCA) et le regroupement hiérarchique (HCA) pour visualiser les relations entre les isolats.

Avantages et Applications de la FTIR

Avantages :

• Rapidité : Permet une "épidémiologie en temps réel", avec des résultats obtenus en 1 à 2 heures après la culture.

• Fiabilité : Génère des spectres comparables dans le temps si les conditions sont standardisées.

• Coût-efficacité : Faible coût par échantillon après l'investissement initial dans l'équipement.

Inconvénients :

• Nécessite des conditions de culture et de préparation très standardisées et répétables.

• La définition de seuils de similarité (cut-offs) pour définir un clone épidémique requiert une validation par comparaison avec des méthodes de référence comme le PFGE ou le séquençage.

Exemples d'études de cas :

• Traçage d'une épidémie de Citrobacter koseri : La FTIR a permis de créer un réseau neuronal pour tracer en temps réel les souches clonales, avec une bonne corrélation avec le PFGE et le cgMLST.

• Épidémie de Klebsiella pneumoniae NDM : La FTIR a démontré une capacité de discrimination supérieure à celle du PFGE pour identifier des sous-groupes au sein de l'épidémie, qui correspondaient à des profils de virulence et de résistance distincts.

• Épidémie d'Acinetobacter baumannii : La FTIR s'est avérée être une alternative fiable et plus rapide que la MLVA et le PFGE pour identifier et suivre une épidémie en unité de soins intensifs.

Points Clés à Retenir

• Le choix de la méthode de typage dépend de l'objectif : investigation d'épidémie locale (RAPD, PFGE), surveillance à long terme (MLST, séquençage) ou dépistage en temps réel (FTIR).

• Les méthodes génotypiques sont généralement plus stables et reproductibles que les méthodes phénotypiques.

• Le PFGE a longtemps été le "gold standard" pour sa haute discrimination, mais il est laborieux et long.

• Le MLST et le séquençage du génome entier (WGS) sont les références actuelles pour la portabilité des données et les études évolutives, grâce aux bases de données centralisées.

• La FTIR émerge comme un outil très prometteur pour l'épidémiologie hospitalière en temps réel, offrant une combinaison unique de rapidité, de faible coût et de pouvoir discriminant élevé.